大豆疫霉菌氧化固醇结合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

丁 鲜, 刘西莉, 张 峰*,

(1.南京农业大学 植物保护学院，南京 210095；2.中国农业大学 植物保护学院，北京 100193)

卵菌是一类形态上类似于丝状真菌，但是在系统发育上与原生藻菌中的硅藻和褐藻相关的真核生物[1]。其中已知60% 的卵菌是植物病原菌，对农业、林业和观赏植被等造成了毁灭性的危害。疫霉属是卵菌中危害最严重的种属，包含了对农业生产和社会经济具有毁灭性破坏作用的植物病原菌，例如导致爱尔兰马铃薯饥荒的马铃薯晚疫病病原致病疫霉Phytophthora infestans[2]、引起的贾拉森林枯死的樟疫霉P.cinnamomzhib及引起栎树猝死的栎树猝死病菌P.ramorum[3]。

大豆疫霉菌 (Phytophthora sojae, Ps) 也属于疫霉属，是一种危害严重且较难防治的土传病原菌，在大豆整个发育和生长期均可为害，如在大豆出苗前后可引起猝倒病，后期可引起大豆根腐病[4]。该病害通常在地下发生，先破坏大豆根部组织，后期向上传播并危害植物茎干，每年在全球可造成10 亿至20 亿美元的经济损失[5]。目前对于大豆猝倒病和根腐病的防治主要依靠化学药剂，最常见的是苯基酰胺类及羧酸酰胺类杀菌剂[6]。

氟噻唑吡乙酮 (oxathiapiprolin) 是杜邦公司于2007 年开发的一款新型哌啶基噻唑异唑啉类卵菌杀菌剂，兼具保护和治疗作用[7]，对植物卵菌病害，如晚疫病、霜霉病、根腐病和茎腐病等具有极高的生物活性[8]。氟噻唑吡乙酮不仅可以抑制病原菌菌丝的生长，还能抑制孢子囊的形成和游动孢子的萌发[7,9]。目前认为氟噻唑吡乙酮的作用靶点为氧化固醇结合蛋白 (oxysterol-binding protein, OSBP)，由于OSBP 是一个全新的杀菌剂靶标，因此氟噻唑吡乙酮与其他杀卵菌剂没有交互抗药性[10]。

OSBP 及OSBP 相关蛋白 (OSBP-related protein,ORPs) 是真核生物中非常保守的脂质转运蛋白，也是一种重要的非囊泡运输蛋白。在细胞的生长和代谢中，特别是在内质网与其他细胞器如高尔基体、质膜等形成的膜接触反应过程中发挥至关重要的作用[11-12]。根据蛋白结构可将ORPs 家族分为两类：一类是短链ORPs，只含有氧化固醇结合蛋白相关结构域 (OSBP-related domain, ORD)；另一类是长链ORPs，其除了在羧基端有ORD 外，还含有Pleckstrin homology (PH) 结构域、Golgi dynamics (GOLD) 结构域、Helical region (跨膜域)及Phenylalanines in an acidic tract (FFAT) 序列[13-15]。所有ORPs 的共同特征是都含有ORD 结构域。第1 个ORD 结构域的晶体结构来源于2005 年解析的酵母的Osh4[16]，后续解析的ORD 晶体结构均来源于酵母和人源。根据已知的三维结构，ORD 可形成β-桶状结构并作为天然配体甾醇类和磷脂酰肌醇类的容器和运输工具，从而维持脂质的动态平衡[17-19]。大豆疫霉菌含两个ORPs 蛋白，分别是长链OSBP 和短链OSBP，两者的蛋白质序列同源性为36.8%。长链OSBP 基因的突变显著影响了菌体对氟噻唑吡乙酮的敏感性，而短链OSBP 基因的缺失表现出与野生型相似的敏感性，即与菌体的药敏性无关[20]，因此长链OSBP 蛋白被认为是氟噻唑吡乙酮的靶标。通过序列比对发现，大豆疫霉菌的长链OSBP (Psosbp) 与人源及酵母OSBP 的蛋白同源性均较低，仅10%到20%，因此利用其他物种来源的OSBP 三维结构分析Psosbp 与氟噻唑吡乙酮的分子互作特征，其结果很可能不是非常准确。另外，目前尚未见卵菌OSBP 蛋白的内源或外源表达及纯化的报道，从而限制了对其结构药理学的深入研究。鉴于此，本研究对Psosbp 蛋白进行了异源表达，利用亲和层析、凝胶过滤层析、Western blot、蛋白稳定性分析及微量热泳动技术得到了具有生物活性的Psosbp 单体融合蛋白，直接证实了氟噻唑吡乙酮可结合氧化固醇结合蛋白，结果为后续在结构层面揭示药-靶互作的机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株和载体 供试菌株大肠杆菌Escherichia coliDH5α 和BL21(DE3)，以及大豆疫霉菌P.sojaecDNA 和载体pET28a，均保存于南京农业大学植物保护学院农药靶标生物学实验室。

1.1.2 主要试剂 同源重组酶2 × Ezmax-single CloneMix Plus、FastPfu Premix 酶和DNA 胶回收试剂盒，均购于上海吐露港生物科技有限公司；限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ，购于大连TaKaRa公司；组氨酸抗体，购于上海爱必信生物有限公司；ECL 化学发光液，购于上海天能生命科学有限公司；甘油 (glycerol)，购于上海沪试实验室器材股份有限公司；脱脂奶粉和Ni-NTA 琼脂糖树脂，购于BBI 生命科学有限公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)，购于BioLeaders 公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和咪唑 (imidazole)，购于上海源叶生物科技有限公司；Tris、NaCl 和卡那霉素 (kanamycin,简称kana)，均购于上海生工生物工程股份有限公司；TEV 蛋白酶、胰蛋白胨 (tryptone)、酵母提取物 (yeast extract)、琼脂粉 (agar powder)、二硫苏糖醇 (DTT) 和乙二胺四乙酸 (EDTA)，购于北京索莱宝科技有限公司；RED-tris-NTA 蛋白标记试剂盒、MO 标准毛细管和Tycho NT.6 毛细管，均购于德国NanoTemoper 科技有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。NdeⅠ-ps600-F 序列：GAAAACCTGTATTTCCAGGGTCATATGGCGAT CTTCCACCCGAAGA，XhoⅠ-ps967-R 序列：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTGG CCGGCAGCTGCGC。测序由安徽通用生物科技公司完成。

1.1.3 培养基 LB (Luria-Bertani) 固体培养基：10 g 氯化钠、10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、琼脂粉16 g，蒸馏水定容至1 L，高温高压121 ℃灭菌20 min。LB 液体培养基是在上述培养基中去除琼脂粉。

1.1.4 主要仪器 Trident960 基因扩增仪，Heal Force 公司；Centrifuge 5424 高速离心机，Eppendorf 公司；Avanti J-26S XP 高速离心机，BECKMAN 公司；APV1000 高压均质机，SPX 公司；AKTA Pure25 蛋白纯化仪和凝胶过滤层析柱SuperdexTM200 Increase 10/300GL，Cytiva 公司；JY-SCZ2 垂直电泳槽、JY-SPCT 水平电泳槽和JY-ZY5 转移电泳槽，北京君意东方电泳设置有限公司；Tycho™ NT.6 和微量热泳动分析仪，德国NanoTemoper 科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 序列分析 使用Clustalx 和ESPript 3.0 软件对Psosbp (XP_009522569) 进行蛋白序列比对。使用Expasy (https://web.expasy.org/protparam/) 预测蛋白的理化性质。使用TMHMM Server,v.2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白的跨膜结构域。

1.2.2 基因扩增及表达质粒构建 为克隆Psosbp-ORD 保守区域的基因序列，选取Psosbp(600-967)作为ORD 结构域，并在其氮端添加麦芽糖结合蛋白 (maltose binding protein，MBP) 增加蛋白的可溶性，使用NdeⅠ-ps600-F 和XhoⅠ-ps967-R 为上下游引物，以大豆疫霉菌cDNA 为模板扩增目的片段。50 μL 扩增体系：2 × FastPfu Premix 25 μL、上下游引物各2 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 20 μL。PCR 程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃充分延伸10 min。对pET28a 载体进行NdeⅠ及XhoⅠ 双酶切，50 μL 酶切体系：1 μg DNA、1 μL NdeⅠ、1 μL XhoⅠ、5 μL 10 × Universal Buffer，补水至50 μL，37 ℃过夜酶切。用DNA 胶回收试剂盒对酶切的载体和片段进行回收，2 × Ezmaxsingle CloneMix Plus 连接酶连接载体和片段，50 ℃反应20 min。连接产物转入DH5α 感受态，挑取阳性克隆转化子测序。

1.2.3 蛋白诱导表达 将表达质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，37 ℃倒置培养，挑取单菌落在添加终浓度为50 mg/L 卡那霉素的液体LB 培养基中，37 ℃过夜振荡培养，并作为母液。取100 μL 菌液留存作Western blot 实验备用，其余菌液按体积比1:100 将其添加到终浓度为50 mg/L 卡那霉素的LB 液体培养基中，进行大量摇培至OD600为1.0 左右，加入终浓度为10-4mol/L 的IPTG，16 ℃振荡诱导表达20 h，取100 μL 菌液留存作Western blot 实验备用，其余菌液离心弃上清，收集菌体。

1.2.4 Western blot 实验 取上述留存的IPTG 诱导前、后的100 μL 菌液离心，加入菌体裂解液(0.05 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、pH 7.5)，充分裂解后，取10 μL 诱导前、后的菌液，在120 V 电压下进行SDS-PAGE 电泳2 h，200 mA 电流转膜2 h。将蛋白转移至PVDF 膜上，用5%的脱脂牛奶封闭2 h，按比例稀释组氨酸一抗，孵育2 h，TBST 缓冲液洗膜3 次，每次5 min；加入按比例稀释的组氨酸二抗，孵育1 h，TBST 缓冲液洗膜3 次，每次5 min；之后加入ECL 化学发光液，进行化学发光显影。

1.2.5 亲和层析纯化 收集经IPTG 诱导表达的菌体用重悬缓冲液 (0.05 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、2.5 × 10-4mol/L 咪唑、10% 甘油、pH 7.5)进行重悬，使用高压均质机破碎，之后在4 ℃、18 000 r/min 条件下离心45 min，取上清液。使用5 倍柱体积重悬缓冲液平衡Ni-NTA 琼脂糖树脂柱，之后向Ni-NTA 琼脂糖树脂柱中加入蛋白上清液，同时收集流穿液；使用5 倍柱体积重悬缓冲液冲洗Ni-NTA 琼脂糖树脂柱；最后使用洗脱缓冲液 (0.05 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、0.25 mol/L 咪唑、10%甘油、pH 7.5) 洗脱目的蛋白并收集洗脱液。

1.2.6 凝胶过滤层析纯化 将SuperdexTM200 Increase 10/300GL 凝胶过滤层析柱与AKTA Pure25 蛋白纯化仪连接，使用含0.02 mol/L Tris-HCl、0.2 mol/L NaCl、10%甘油、1 × 10-3mol/L DTT、1 × 10-3mol/L EDTA、pH 7.5 的缓冲液平衡层析柱，通过上样环进行蛋白上样，设置程序洗脱并收集样品。

1.2.7 蛋白稳定性分析 调整蛋白的质量浓度为0.10 mg/mL，用Tycho NT.6 毛细管吸取凝胶过滤层析收集的单体蛋白，使用MBP-TEV-His6 蛋白作为对照，将样品置于Tycho™ NT.6 样品槽中，选择程序。仪器在加热过程中，用280 nm 去激发色氨酸和酪氨酸，然后测定330 nm 和350 nm 的发射光以及它们的比值，来评估蛋白热稳定性。

1.2.8 蛋白生物活性分析 调整蛋白终浓度为50 nmol/L，药剂浓度为40 μmol/L，按照REDtris-NTA 蛋白标记试剂盒对蛋白进行标记。选择Binding check 程序，通过MO 标准型毛细管上样，通过信噪比数值评估MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 以及对照MBP-TEV-His6 与氟噻唑吡乙酮结合情况。

2 结果与分析

2.1 Psosbp 结构域预测及生物信息学分析

以已经解析晶体结构 (PDB 号：5ZM5) 的人源OSBP 蛋白序列与Psosbp (XP_009522569) 进行序列比对 (图1)，在不破坏二级结构的前提下，选取Psosbp 第600 位至967 位氨基酸，即Psosbp (600-967) 为ORD 结构域，用于后续蛋白表达质粒的构建。Psosbp(600-967) 基因序列编码368 个氨基酸，无跨膜区。经Expasy 预测，Psosbp(600-967)蛋白分子质量为40.96 kDa，理论等电点PI 为8.26。重组蛋白MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白分子质量为83.7 kDa，理论等电点PI 为6.18。

2.2 重组表达质粒的构建与鉴定

重组蛋白表达质粒图谱见图2A。将质粒转化后的阳性转化子进行验证测序，使用限制性内切酶NdeⅠ 和XhoⅠ对阳性转化子进行质粒酶切验证。如图2B 所示，酶切后分别产生6353 bp 和1131 bp 的产物，与预期相符。将重组表达质粒测序，证实质粒无碱基移位和突变，符合下一步蛋白表达的要求。

2.3 Psosbp 蛋白的可溶性诱导表达条件

对包含pET28a-MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 质粒的BL21(DE3) 大肠杆菌菌株进行诱导表达，如图3A 所示，受IPTG 诱导后，BL21(DE3)可成功特异性表达目的蛋白。同时通过组氨酸抗体对IPTG 诱导前后菌液进行了Western blot 实验，确定表达出来的蛋白是预先设计的蛋白 (图3B)。

图3 pET28a-MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 在BL21(DE3) 中的诱导表达前后电泳结果(A) 和Western blot 结果(B)Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blot analysis (B) of induced expression of pET28a-MBP-TEV-Psosbp (600-967)-His6 in BL21 (DE3)

2.4 重组蛋白的亲和层析纯化

将含有重组蛋白的上清液用Ni-NTA 琼脂糖树脂柱进行亲和层析纯化。结果显示，洗脱液中含有含量及纯度均较高的重组蛋白 (图4)。

图4 MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白纯化电泳结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of MBP-TEV-Psosbp (600-967)-His6 protein purification samples

2.5 重组蛋白的凝胶过滤层析纯化

MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 重组蛋白经凝胶过滤层析 (图5A)，收集样品进行SDS-PAGE(图5B)。参考标准蛋白层析Marker 以及SDSPAGE 测定结果，表明MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 重组蛋白得到较好的分离，并主要以单体蛋白状态存在。将TEV 蛋白酶与融合蛋白以质量比1：50 孵育以期望切除MBP 标签，发现Psosbp(600-967) 蛋白出现大量沉淀。以上结果说明，MBP 可以增加Psosbp(600-967) 蛋白的可溶性，并具有稳定蛋白性质的作用，故后续均使用重组蛋白来开展实验。

图5 MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白凝胶过滤层析纯化电泳结果Fig.5 Purification of MBP-TEV-Psosbp (600-967)-His6 protein by gel filtration chromatography

2.6 重组蛋白稳定性分析

Tycho™ NT.6 分析MBP-TEV-His6 曲线 (图6A)与NanoTemper 官网MBP 曲线对照图吻合，MBPTEV-Psosbp(600-967)-His6 曲线呈“S”形 (图6B)，蛋白在拐点处的温度发生去折叠，温度Ti为61.5 ℃。结果表明，重组蛋白MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 较为稳定，具有完整的蛋白高级结构，且MBP 的存在未破坏蛋白的高级结构。

图6 MBP-TEV-His6 (A) 和MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 (B) 蛋白稳定性分析曲线Fig.6 Protein stability analysis of MBP-TEV-His6(A) and MBP-TEV-Psosbp (600-967) -His6(B)

2.7 重组蛋白活性分析

使用微量热泳动中Binding check 程序分别测试了MBP-TEV-His6 和MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 与药剂氟噻唑吡乙酮是否存在结合。信噪比用于评估结合数据的质量，信噪比大于5 可定义为靶标与配体有结合。MBP-TEV-His6 在添加氟噻唑吡乙酮后，信噪比为1.2，明显小于5，故两者无结合活性 (图7A)；而MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 添加氟噻唑吡乙酮后，信噪比为14.3，远大于5 (图7B)，因此判断MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 蛋白具有与抑制剂结合的活性。

图7 MBP-TEV-His6(A)与MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6(B)与氟噻唑吡乙酮微量热泳动曲线Fig.7 MST analysis of MBP-TEV-His6 (A) and MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 (B) with oxathiapiprolin

3 结论与讨论

氧化固醇结合蛋白 (OSBP) 及其相关蛋白 (ORPs)涉及许多细胞过程，包括信号传导、囊泡运输、脂质代谢和非囊泡运输等，比如在酵母和人类细胞中，ORPs 可促进甾醇和其他磷脂在细胞内膜之间的运输。质膜中磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 (PI(4,5)P2)的平衡被打破时，会导致代谢紊乱以及诱导肿瘤的发生，因此人源ORPs 和其他ORPs 与细胞信号调节和肿瘤的发生可能有关联[21-22]。植物病原菌中的OSBP 作为一种新型的卵菌专化型杀菌剂靶标，其抑制剂氟噻唑吡乙酮具有超高活性及反抗性等特点[7]。然而，目前室内试验已分离出马铃薯晚疫病菌P.infestans、辣椒疫霉病菌P.capsici和寄生疫霉病菌P.parasitica对氟噻唑吡乙酮的抗药性菌株[23]，并通过CRISPR-Cas9 证明了几个关键氨基酸位点突变后其突变体菌株的抗性指数超过1000，说明疫霉菌对氟噻唑吡乙酮具有中、高水平抗性风险[24]。因此，对氟噻唑吡乙酮与靶标OSBP 蛋白互作机制的研究，将为设计对氟噻唑吡乙酮反抗性的新型OSBP 抑制剂奠定重要的基础。

已知OSBP 与配体的三维结构的解析仅限酵母和人源，而植物病原菌的OSBP 三维结构尚未报道。鉴于不同物种之间蛋白质序列同源性较低，利用结构预测的方式模建植物病原菌的OSBP 三维结构可能不准确。得到均一的及纯度较高的蛋白质是解析蛋白质三维结构和研究蛋白质生物化学的基础，然而目前尚未见关于植物病原菌OSBP 蛋白异源表达及纯化的报道。已有研究结果表明，利用大肠杆菌表达系统表达酵母氧化固醇结合蛋白Osh1 的ORD，蛋白折叠错误形成高聚，但在蛋白表达过程中加入Osh1 配体麦角甾醇，蛋白存在状态由高聚变为单体[18]。因此本研究前期也尝试在大豆疫霉菌Psosbp(600-967)-His6表达过程中加入配体麦角甾醇，但Psosbp(600-967)-His6 蛋白仍出现错误折叠，存在状态为包涵体，因此需要重新建立新的适于卵菌OSBP 表达及纯化的方法。我们曾尝试添加其他促溶标签，但Psosbp(600-967) 蛋白的存在状态未发生改变，只有麦芽糖结合蛋白MBP 标签显著提高了蛋白Psosbp(600-967) 的可溶性，且经亲和层析和凝胶过滤层析分离后，MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6 重组蛋白纯度较高。之后我们利用Tycho™NT.6 测试发现蛋白具有稳定的、完整的蛋白质高级结构，最后利用微量热泳动证明了蛋白具有与药剂结合的生物活性。

综上所述，本研究成功构建了大豆疫霉菌氧化固醇结合蛋白Psosbp 大肠杆菌异源表达、纯化及活性鉴定体系，获得了足量的、纯度较高且具有生物活性的重组蛋白，直接证实了氟噻唑吡乙酮可结合氧化固醇结合蛋白，为后续药-靶三维结构的解析了奠定基础，同时为以OSBP 为靶标的新型卵菌抑制剂的开发提供了依据。