新疆维吾尔族异基因造血干细胞移植病儿血浆中伏立康唑的浓度测定

赵婷，张惠兰，沈浩，冯杰，刘思明，王婷婷，李红健，于鲁海

伏立康唑（voriconazole）可用于预防接受异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell，HSCT）的高危病人的侵袭性真菌感染［1-2］。伏立康唑具有非线性动力学特征［3］，血药浓度治疗窗狭窄（0.5～5.0 mg/L）［4］。目前，伏立康唑在维吾尔族异基因HSCT高危病儿中的治疗药物监测数据有限。因此，我们采用高效液相色谱-质谱联用（liquid chromatogra‑phy-tandem mass spectrometry assay，LC-MS/MS）技术来灵敏、快速检测伏立康唑稳态血浆谷浓度，并探讨伏立康唑血浆谷浓度在异基因HSCT 病儿中的分布特征。

1 方法

1.1 仪器、试剂和试药高效液相色谱-质谱联用仪（4500 型，上海AB SCIEX 分析仪器有限公司）；电子天平（BP221S型，德国赛多利斯公司）。伏立康唑和伏立康唑同位素内标均购自中国食品药品检定研究院（纯度>98%）；色谱甲醇、甲酸（美国Fisher公司）。

1.2 色谱及质谱条件色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（3.0×50 mm，2.5 µm），流动相A：0.1%的甲酸水溶液，流动相B：0.1%的甲酸乙腈溶液，梯度洗脱（0~0.2 min，A 95%~B 5%；0.2~1.2 min，A 70%，B 30%；1.2~2.4 min，A 30%，B 70%；2.4~1.3 min，A95%，B 95%）；柱温40 ℃；进样量2 µL；流速0.4 mL/min。

质谱条件：正离子模式；离子喷射电压：5 500 V；温度：600 ℃；GSl：50；GS2：50；Curtain gas：30。伏立康唑离子对350.2/127.1，同位素内标离子对353.2/130.1，碰撞能量均为20 eV。

1.3 溶液的配置精密称取伏立康唑内标10 mg和同位素内标1 mg，用甲醇配置成浓度为1 mg/L 储备液和5 mg/L 内标溶液。再稀释配制伏立康唑标准曲线系列溶液（浓度为2、5、10、20、50、100、200 mg/L）。同时，以甲醇分别配置4 种具有代表性伏立康唑浓度水平的质控样品溶液，即定量下限（lower limit of quantification，LLOQ，2.0 mg/L）、低浓度质控（low quality control，LQC，5.0 mg/L）、中浓度质控（middle quality control，MQC，60.0 mg/L）和高浓度质控（high quality control，HQC，150.0 mg/L）。

1.4 方法学考查

1.4.1专属性考察 测定并记录空白血浆、空白血浆+伏立康唑标准液、空白血浆+内标、空白血浆+伏立康唑标准液+内标和病儿样品色谱图，具体见图1。

图1 伏立康唑和内标色谱图：A为空白血浆；B为空白血浆+内标；C为空白血浆+伏立康唑；D为病儿血浆样品

1.4.2线性关系考察和定量下限测定 在80 µL 空白血浆中分别加入伏立康唑标准系列浓度溶液10µL 和内标溶液10 µL，得到0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L 的系列标准血浆样本溶液后进样分析。以伏立康唑与内标的色谱峰面积比值为应变量，浓度为自变量，用加权最小二乘法进行回归分析。以信噪比S/N≥4 考察该药物的检测下限，信噪比S/N≥12考察该药物的定量下限。

1.4.3方法精密度和准确度 配制LLOQ（0.2 mg/L）、LQC（0.5 mg/L）、MQC（6.0 mg/L）和HQC（15.0 mg/L）4 个浓度的质控生物样品各5 份，每个浓度进样3 针，连续测定3 d，计算日内、日间精密度和准确度。

1.4.4提取回收率 配制LLOQ、LQC、MQC 和HQC 4 个浓度的伏立康唑质控标准溶液和生物样品各6份，进样分析，并计算提取回收率。

1.4.5稳定性试验 分别考察LQC 和HQC 的质控生物样品室温稳定性（室温放置4 h）、短期稳定性（-4 ℃，24 h）、长期稳定性（-30 ℃，30 d）、冻融稳定性（-24 ℃下反复冻融3次，每次至少间隔12 h）。稳定性质控样品按上述条件分别放置一段时间后进行色谱分析，比较其测定值与0 h 质控样品测定值的偏差。

1.5 病儿样品测定及临床资料收集收集204 例就诊于新疆维吾尔自治区人民医院血液科并规律服用伏立康唑的维吾尔族异基因HSCT 的病儿。所有病儿在测定当日早晨空腹抽取静脉血1~2 mL（3 500 r/min，-4 ℃离心5 min），分离血浆后精密吸取50 µL，加入内标10 µL，蛋白沉淀剂200 µL，混合离心（12 000 r/min，10 min）后过滤测定。收集并随访了所有入组病儿的一般资料（年龄、性别、体质量指数、服药剂量等）和稳态血浆谷浓度。病人或其近亲属知情同意，本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会审核批准（批号XJS2021111809）。

2 结果

2.1 专属性研究结果显示：伏立康唑的离子对跃迁的离子对：350.2/127.1，同位素内标的离子对跃迁的离子对：353.2/130.1。图1 显示了伏立康唑和IS的离子对跃迁的代表性色谱图。在伏立康唑的洗脱和无药物空白人血浆中的IS 中未检测到干扰峰。在LLOQ 样品（图1C）和给药后产生的样品（图1D）中，伏立康唑和IS 保留时间均约1.84 min。此外，在定量样品上限（20 mg/L）之后注入的空白血浆样品的色谱图中未检测到残留。

2.2 线性关系考察和定量下限测定伏立康唑血药浓度在0.2~20 mg/L 范围内线性关系良好（Y=1.107 2X-0.051 3，r2≥0.999 7），检测下限为0.1 mg/L（S/N=4），定量下限为0.2 mg/L（S/N=12）。

2.3 方法精密度和准确度伏立康唑测定的日内和日间精密度使用四个水平的质控样品进行评估，包括LLOQ、LQC、MQC 和HQC（见表1）。表1 结果表明：日内和日间精密度的变异系数（coefficient of variation，CV）值不超过7.39%，准确度的偏差（devia‑tion from nominal value，Bias）范围为- 1.11%~14.56%。

表1 精密度和准确度结果（伏立康唑血药浓度）

2.4 提取回收率伏立康唑的4 个质控样品（LLOQ、LQC、MQC 和HQC）的提取回收率分别为85.46%、90.78%、95.55%和94.11%，RSD 值均小于15.0%。IS的平均绝对值为86.41%。见表2。

表2 伏立康唑的提取回收率

2.5 稳定性试验稳定性试验结果表明，伏立康唑的2个质控样品（LQC和HQC）的未前处理和经过前处理血浆样品的短期、长期和冻融冻存稳定性均较好（CV<5%；Bias 为-0.28%～12.29%；CV<10%；Bias为-3.56%～2.85%）。见表3。

表3 伏立康唑的稳定性试验结果

2.6 伏立康唑血浆药物浓度测定结果分析病儿一般资料见表4。病儿平均年龄为10.13 岁；男性病儿比例为67.65%（n=138），伏立康唑平均给药剂量为14.31 mg/d，血浆谷浓度为3.11 mg/L。

表4 规律服用伏立康唑的维吾尔族异基因造血干细胞移植（HSCT）病儿204例一般临床资料

3 讨论

本研究首次建立的测定伏立康唑血药谷浓度的LC-MS/MS 方法基于临床实践病人样本，提供了临床环境的真实代表。

3.1 测定方法的优缺点优点：目前测定伏立康唑血药浓度的高效液相色谱法［5-9］和LC-MS/MS 法［9-11］在样品量、样品制备方法、色谱柱等方面有所不同。有研究［12-15］使用了较为复杂的固相萃取、液-液萃取，或更昂贵的色谱设备。我们建立的LC-MS/MS方法使用了较为简单的蛋白质沉淀方法，可以将实验操作过程减少到四个步骤，检测人员可以快速轻松的完成相关操作，如15个伏立康唑血浆样品可以在20 min 内完成所有前处理过程。本研究建立的LC-MS/MS 法的分析速度快、灵敏度高，一次样品的运行时间在3 min 内就可以完成，可及时为临床个体化用药提供依据。此外，该方法只需要50 µL 的血浆，这使得该方法可以更好的应用于儿童病人。

缺点：由于该LC-MS/MS 法的灵敏度较高，故测定的各个环节对测定的干扰均较大，尤其是样本前处理过程。其次，该仪器比较昂贵，不能广泛应用于新疆的边远地区。

3.2 操作过程中的注意事项（1）本方法的流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，因此，采用有机相和水相相结合的混合膜。（2）流动相必须脱气处理，否则会造成基线不稳。（3）由于本研究测定的是生物样本，样本的前处理中的除蛋白过程对色谱系统的干扰较大，因此，样本经0.22 µm 过滤器过滤后再进样测定。

3.3 研究意义目前，我院的伏立康唑样品被送到其他实验室进行血药浓度测定，其存在的主要问题是3～6 d 的周转时间，使临床调整其给药剂量不及时。为了解决这个问题，我们开发并验证了一种适用于儿科病人的快速、灵敏的LC-MS/MS 定量伏立康唑方法血浆谷浓度。此外，伏立康唑血浆谷浓度<1 mg/L 时治疗效果较差［16-18］。伏立康唑谷浓度>5 mg/L 时易引发药物的毒性反应［19-20］。本研究结果显示有9例病儿伏立康唑血浆谷浓度<0.5 mg/L导致疗效较差，26 例伏立康唑谷浓度>6 mg/L 的病儿引发了谷丙和谷草转氨酶升高。因此临床及时进行伏立康唑治疗药物监测是非常有必要的。