川滇桤木4 种气味活性物质对云南切梢小蠹胚后发育的影响

钱路兵张梦蝶刘金林李宗波,3

（1. 西南林业大学生物多样性保护院，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650233；2. 西南大学植物保护学院，重庆 400715；3. 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650233）

云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）是一种以云南松（Pinus yunnanensis）为寄主的蛀干害虫，该蠹虫自20 世纪80 年代在云南中部大爆发以来，现已扩散至四川、贵州、广西等云南松（Pinus yunnanensis）的原生分布区[1-2]，严重威胁我国西南地区云南松松林生态系统的安全及生物多样性。云南切梢小蠹1 年发生1 代，具有干转梢、梢转梢和梢转干3 个独特的生活时期。其中，在松梢中补充营养物质，完成生殖器官的成熟，并会导致云南松的生长势衰弱；在树干韧皮部进行交配、产卵，并完成胚后发育，最终致使树木死亡[2]。尽管云南切梢小蠹会有一个短暂的转移期，但其90%以上的生活史均在树木内部度过，隐蔽的生活方式决定了云南切梢小蠹的防治难度大。目前，营造针阔混交林被认为是防治云南切梢小蠹最为有效的方式。在混交林生态系统中，非寄主林木与寄主林木之间常因时间和空间的持续变化，形成独特的空间分布与配置的关系，一方面能够增加物种的多样性，增强物种之间的互作关系和制衡能力（如天敌、捕食者、寄生蜂），从而降低害虫的危害程度和发生频率[3]；另一方面在于非寄主林木释放的特征气味谱，可直接影响或干扰害虫的多种行为[4-5]。如绿叶挥发物能够大幅度地降低云南切梢小蠹、南部松大小蠹（Dendroctonus frontalis）、中穴星坑小蠹（Pityogenes chalcographu）对聚集信息素和寄主气味的趋向性，影响其寄主识别能力[5-7]。树皮挥发物苯甲醇、苯甲醛、愈创木酚、邻羟基苯甲醛以及7-甲基-1,6-二氧螺环[4-5]癸烷（又称conophthorin）可干扰害虫产卵地的选择，延长求偶时间，缩短交配持续期，也会增加天敌的非致死效应[4,8-10]。并且，非寄主林木气味也是混交林气味的重要组成部分，且这些气味物质无时不有，无处不在，很可能作为一种间接的环境胁迫因子[5,11]。相较于其他害虫，云南切梢小蠹的主要生活史均在树干的坑道内完成，生活环境也相对封闭，推测这些无时不在的非寄主气味，特别是活性气味物质，很可能作为一种非致死效应而直接影响云南切梢小蠹的发育和存活几率。因此，采用前期筛选的非寄主林木—川滇桤木（Alnus ferdinandi-coburgii）的气味活性物质，用生测法持续干扰云南切梢小蠹的胚后发育，以验证非寄主林木气味对害虫繁殖机能的影响，并为深入理解混交林抑制害虫种群数量提供参考。

1 材料与方法

1.1 云南切梢小蠹的胚后发育及形态特征

云南切梢小蠹的生殖器官发育成熟后，于当年10 月至翌年3 月开始蛀入树干，待雌雄两性在交配室内交配后，雌虫即沿树干纵向方向蛀食，并将卵产于母坑道左右两侧（图1a）。卵呈椭圆形，长（1.02 ± 0.11）mm，宽（0.63 ± 0.05）mm，乳白色。卵经历5～12 d 便会孵化为幼虫，幼虫沿着与母坑道垂直的方向进行取食，形成子坑道，每个幼虫均在自己的坑道内发育；幼虫体稍微弯曲，粗而多皱纹，有3 龄。其中，1 龄幼虫呈淡黄褐色，头壳宽0.2～0.6 mm；2 龄幼虫为黄褐色，头壳宽0.64～0.90 mm；3 龄幼虫为橙黄色，头壳宽0.92～1.28 mm[12]。1.5～2 个月后，幼虫就会在坑道末端的蛹室内化蛹，新蛹呈乳白色，随后复眼、口器和翅逐渐变成黑褐色。蛹经历20～25 d 后，逐渐羽化为成虫，新成虫呈淡黄褐色，鞘翅末端2/3 处最先开始出现黑色斑块，随后整体呈黑褐色（图1b）。成虫在蛹室内待4～7 d 后，则会从蛹室上方咬开羽化孔爬出树干，寻找合适的嫩梢补充营养，开始新的生命循环。

图 1 云南切梢小蠹的坑道特征和胚后发育Fig. 1 Single maternal gallery and post-embryonic development of T. yunnanensis

1.2 气味活性物质的筛选与来源

前期在抗云南切梢小蠹混交树种的筛选过程中，已发现用川滇桤木营造的针阔混交林，能够很好地削弱云南切梢小蠹的危害，随后用昆虫电生理和行为选择实验筛选出对乙基苯乙酮、反-2-己烯-1-醇、顺-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚对云南切梢小蠹有趋避活性[13]。干扰实验使用的4 个化合物以及对照试剂，均从商业公司购买的标准化合物，见表1。

表 1 干扰用的活性气味物质及来源Table 1 Description of odor-active compounds employed in stressing experiments for T. yunnanensis

1.3 气味活性物质的干扰实验

将从云南松松林采集的、生殖器官已发育成熟的云南切梢小蠹带回实验室，先根据腹部背板形态以及是否可见第8 节的特征区分雌雄，然后按照雌、雄各15 只的方式放在广口玻璃瓶（高50 cm，直径25 cm，体积20 L）中。瓶内先放置2 根新鲜的云南松木段，木段长30 cm，直径10 cm，且两端用液体石蜡封闭保湿，用纱布封住瓶口，以便于云南切梢小蠹的侵入和繁殖。待见到木段表面或瓶底有木屑后，意味着雌雄已完成了交配，雌虫开始蛀坑产卵，随即将内含活性气味物质（0.45 ng/μL，溶剂为正己烷）的缓释瓶置于广口瓶瓶底，每隔15 d 更换1 次。每个化合物设置3 次重复，并以溶剂（正己烷）和对小蠹虫具有较强引诱效果的寄主活性成分（α-蒎烯）为对照[14]。最后，将处理好的广口瓶放置在养虫室内进行饲养，每隔15 d 各取一木段进行解剖，收集云南切梢小蠹幼虫（1～3 龄）、蛹及新羽化成虫（图1b），将其置于蔡氏体式镜下拍照（Ste-REO Discovery V20, Geman），并用微量天平测量其体质量。

1.4 数据处理与分析

将体视镜拍摄的照片导入ImageJ（Version 1.53c, http://imagej.nih.gov/ij）软 件 中，分 别 对 云南切梢小蠹的幼虫、蛹、成虫、头壳以及正常羽化木段内的母坑道和子坑道等指标进行量化，再根据卵室的数量判断雌虫的产卵量。随后，采用单因素方差分析或者Kruskal-Wallis 检验分析气味活性物质对云南切梢小蠹胚后发育的影响程度。所有的数据分析均在开源软件Rstudio 中（R Version 4.0.5, https://cran.r-project.org/）完 成，作图使用GraphPad Prism（Version 8.0.2）。

2 结果及分析

2.1 气味胁迫对雌虫产卵量与蛀食坑道的影响

与对照相比，云南切梢小蠹在4 种非寄主气味胁迫下的产卵量没有显著的变化，产卵量均在50～60 粒（表2）。但是，雌成虫在产卵过程中蛀食的母坑道有显著的增长（P＜0.05），尤其是对乙基苯乙酮、顺-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚，母坑道的长度分别增加了60.47%、55.68%和36.84%，但卵与卵之间的间距没有明显的变化。当卵孵化后，幼虫在子坑道内取食，4 种气味活性物质均能显著增加幼虫蛀食的坑道长度（P＜0.05）。其中，4-烯丙基苯甲醚增加的最多，达到47.91%，而顺-4-己烯-1-醇增加比例最低，仅为13.07%（表2）。

表 2 气味活性物质对云南切梢小蠹产卵与坑道的影响Table 2 Responses of egg production and maternal gallery of T. yunnanensistressed by the odor-active compounds

2.2 气味胁迫对幼虫的影响

在幼虫发育阶段，4 种非寄主气味活性物质均能够显著增加幼虫各发育阶段的体长（P＜0.01），以反-2-己烯-1-醇的增加得最多，其次为对乙基苯乙酮，顺-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚增加的最少（表3、图2）。并且，反-2-己烯-1-醇、对乙基苯乙酮和4-烯丙基苯甲醚对幼虫的影响效果一致，即从1 龄幼虫至3 龄幼虫呈先高后低的趋势，而顺-4-己烯-1-醇则为先低后高的趋势（图2）。与对照相比，4 种气味活性物质均能够增加幼虫的体质量，但并没有显著差异（表3）。

表 3 气味活性物质对云南切梢小蠹的幼虫发育的影响Table 3 Responses of larval development of T. yunnanensisstressed by the odor-active compounds

图 2 气味活性物质对云南切梢小蠹体长的相对增加比例的影响Fig. 2 Relative percentage of lengthened body length ofT. yunnanensislarvae stressed by the odor-active compounds

2.3 气味胁迫对蛹和新羽化成虫的影响

与对照相比（图3），4 种气味物质均能显著降低云南切梢小蠹蛹（P＜0.01）和新羽化成虫的体长（P＜0.01），以蛹的效果最好，顺-4-己烯-1-醇、对乙基苯乙酮和4-烯丙基苯甲醚的降幅分别为16.63%、14.45%和13.68%，而反-2-己烯-1-醇则为6.95%。在体质量方面，4 种气味活性物质干扰效果并不一致，反-2-己烯-1-醇、顺-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚能够显著地降低蛹（P＜0.01）和新羽化成虫的体质量（P＜0.01），以反-2-己烯-1-醇效果最佳，前者降幅为20.09%，后者降幅为15.78%；但对乙基苯乙酮则会小幅度增加蛹和成虫的体质量，但效果并不明显。

图 3 气味活性物质对云南切梢小蠹蛹与新羽化成虫的影响Fig. 3 Responses of pupa and newly eclosed adults of T. yunnanensisstressed by the odor-active compounds

3 结论与讨论

四种川滇桤木气味活性物质均能明显干扰云南切梢小蠹的胚后发育，特别是绿叶气味成分—反-2-己烯-1-醇和顺-4-己烯-1-醇能够直接降低蛹和成虫的个体大小和体质量，进而影响云南切梢小蠹后续的寄主识别过程及其存活能力，为深入理解针阔混交林降低害虫种群数量提供了另一例证。

获取食物是物种繁衍后代的本能需求。然而，其取食活动除了受到自身生理状态影响外，还会受到各种外界因素的影响。如气温变暖引起中欧山松大小蠢（D. ponderosae）、黄杉大小蠹（D. rufipennis）的种群数量大爆发[15-16]、地球磁场改变导致褐飞虱（Nilaparvata lugens）新羽化雌、雄成虫的体质量显著下降（14.67%）和（13.17%）[17]、苯并二唑衍生物能够直接抑制地中海实蝇（Ceratitis capitafa）保幼激素与受体的结合[18]、种间竞争声信号能够降低南部松大小蠹母坑道长度，并会增加成虫羽化死亡率[19]。对小蠹虫而言，尤其是针叶树皮小蠹，在坑道内取食是其获取营养物质和能量的唯一来源，其产卵量亦会随着坑道长度的增加而增加[2]。在本研究中，4 种气味活性物质胁迫能够增加云南切梢小蠹的母坑道长度，但平均产卵量和卵间距没有显著的变化，这可能与其在生殖上所分配的能量是恒定的有关，生殖前增加或减少自身营养并不会影响其对生殖所分配的能量，如饥饿并不会影响中欧山松大小蠢的产卵量[20]。另一种可能就是气味化合物抑制了雌成虫的能量转化效率，如合成卵黄原蛋白或卵母细胞受体[18,21]，使其必须通过摄取更多的食物才能获取与对照组等量的营养，幼虫期既是一个明显的例证，也是云南切梢小蠹对不良环境的一种生理响应，类似于生活在南北两极的昆虫为抵抗低温而拥有更高的代谢速率、欧洲葡萄蛾（Lobesia botrana）幼虫在温度增加时会增加取食来补充自身的能量[22]。Huber 等[5]发现反-2-己烯-1-醇、顺-4-己烯-1-醇、1-乙烯基己醇等绿叶气味能够降低中欧山松大小蠢、西部松大小蠹（D. brevicomis）、黄杉大小蠹幼虫的取食量，这与本研究的结果并不一致，可能暗示着通用的绿叶气味物质的干扰性质不同，正如反-2-己烯-1-醇干扰效果呈下降趋势，而顺-4-己烯-1-醇呈上升趋势（图2）。另一方面，大量的研究已经证明昆虫激素存在低促高抑的现象，昆虫对不同浓度的同种化合物同样存在较大的差异[2,23]。在蛹期，受化合物干扰后的云南切梢小蠹的体长及体质量均出现不同程度的减少，这可能因它们幼虫期拥有较快的代谢导致蛹期消耗更多的能量，从而导致了该阶段以及新羽化成虫的体长和体质量减少[20-21,23]。

混交林作为有害生物生态调控的重要措施之一，已被证明能够有效抑制害虫的种群数量，目前已有资源集中假说、寄主可见性假说、天敌假说等对其进行解释[3-4]，但本研究发现非寄主林木气味能够降低害虫的繁殖机能，尤其是蛹和成虫，将对其以后的存活、繁衍，甚至种间的互作和级联关系等产生明显的影响。如昆虫的体长和体质量常作为衡量其繁殖力的一个重要特征。红脂大小蠹在求偶的时候，雌虫更偏爱体型更大的雄性，因为体型大意味着优良的后代；同样的，雄虫也偏爱选择体型更大的雌虫，因为体型越大意味着能够产生更多的后代[24-25]。并且，在雄性间的竞争中，体型大小也是一个决定性因素，往往个体较大者容易在竞争中获胜，容易实现自我繁殖适合度[26-27]。此外，个体小，体质量轻的个体，容易在扩散迁飞和寄主识别过程中死亡，或者被天敌或捕食者杀死[2,28-29]，这可能是混交林抑制害虫种群数量的重要因素之一。对于云南切梢小蠹来说，考虑到不同坑道间幼虫发育程度，以及坑道相互交错而致使部分幼虫缺少食物而死亡（死亡率约为39.85%）[2]，非寄主气味干扰后幼虫取食量增加可能会进一步加剧种内竞争。因此，在其种群密度较高时，未来是否可用非寄主气味持续干扰来增加云南切梢小蠹的死亡率有待研究。