血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3在AFP阴性肝细胞癌患者中的表达及临床预后价值*

武彩虹,钱成荣,银广悦,侯学伶,韩玉成,田雪梅

河北中石油中心医院检验科,河北廊坊 065000

肝癌是全世界第五大常见恶性肿瘤,死亡率位于所有肿瘤的第4位[1]。肝细胞肝癌(HCC)是肝癌最常见的病理类型,由于HCC患者早期症状不明显,当出现腹痛、黄疸等症状时,多已处于中晚期,患者5年生存率仅为15.7%[2]。目前HCC的预后主要依据肿瘤分期、血清甲胎蛋白(AFP)等进行综合评估,但临床中仅有60%～70%的HCC患者血清AFP水平升高,并且由于肿瘤的异质性,相同肿瘤分期的HCC患者预后差异较大[3]。因此,有必要寻找新的有效评估AFP阴性HCC(AFP-NHCC)患者的血清标志物。外泌体是直径<100 nm的细胞外囊泡,能够在细胞之间转移蛋白质、DNA和各种形式的RNA,例如微小RNA、长链非编码RNA(LncRNA RNA),它们参与机体生长发育、炎症及肿瘤等多种病理生理学过程[4]。LncRNA RNA是长度在200～300个核苷酸的RNA分子,其可作为分子支架,调控下游癌基因的表达,参与促进HCC的肿瘤进展[5]。LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3是近年来发现的外泌体来源的LNC RNA,是新的HCC早期诊断生物标志物[6-7]。但目前LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3在HCC中的预后价值尚不清楚。本研究通过检测AFP-NHCC患者血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3水平,分析二者与临床病理特征的关系,探讨二者的临床预后价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年12月至2019年6月于本院就诊并接受肝癌根治术的AFP-NHCC患者102例为AFP-NHCC组。纳入标准:(1)经过超声、计算机断层扫描或磁共振成像等影像学检查及术后病理组织检查确诊为原发性HCC;(2)AFP<20 μg/L;(3)首次诊治;(4)临床资料完整。排除标准:(1)既往接受手术、放疗、化疗等治疗;(2)其他病理类型的肝癌;(3)合并急性感染性疾病;(4)合并其他恶性肿瘤。其中男70例,女32例;年龄42～73岁,平均(62.34±5.90)岁;病理分化程度:高中分化54例,低分化48例;肿瘤最大径:≤5 cm 72例,>5 cm 30例;肿瘤结节数目:<2个80例,≥2个22例;包膜完整63例,不完整39例;肝癌巴塞罗那临床分期(BCLC分期):0～A期41例,B～C期61例;伴有肝内淋巴结转移38例,无肝内淋巴结转移64例。以同期于本院进行体检的体检健康者80例作为对照组,其中男50例,女30例;年龄40～72岁,平均(61.18±6.10)岁。本研究经本院伦理委员会审核批准通过。

1.2仪器与试剂 透射电镜购自日本高新技术公司,型号HT7700;外泌体RNA分离提取试剂盒购自美国Invitrogen公司,型号R4319-02;外泌体反转录试剂盒购自北京索莱宝公司,货号RP1105,反转录引物由上海华大公司设计合成。

1.3方法

1.3.1外泌体分离,鉴定及外泌体RNA提取 取各组研究对象清晨空腹肘静脉血5 mL,加入凝胶促凝管中,采血管37 ℃静置30 min,血块凝集后放置离心机上离心,3 000 r/min离心15 min,吸取上清液置于离心管中。取0.5 mL血清,加入0.25 mL外泌体沉淀试剂,混匀后4 ℃孵育30 min,沉淀外泌体,12 000 r/min离心15 min,去上清液,加入0.2 mL缓冲液,重悬收集外泌体。外泌体鉴定:取10 μL外泌体用100 μL PBS重悬,5%戊二醛固定,取10 μL稀释标本滴到碳涂层铜板上,浸入2%磷钨酸30 s后,采用透射电镜观察外泌体形态为双圆盘结构的囊泡,大小在30～200 nm。加入0.4 mL裂解液后,涡旋重悬外泌体,加入0.2 mL无RNA酶水和20 μL蛋白酶K,55 ℃孵育15 min,加入0.6 mL PCL2缓冲液涡旋后于4 ℃,12 000 r/min离心15 min,取外泌体悬液加入两倍体积的无水乙醇,将混合液转移到柱子上,12 000 r/min离心30 s,重复3次,将20 μL无RNA酶水加到柱子膜中央,静置2 min后12 000 r/min离心1 min,获得外泌体总RNA。

1.3.2实时荧光定量PCR(qPCR)检测血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3 将外泌体总RNA反转录为cDNA,反转录条件为37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。然后进行qPCR检测,LncRNA 00853引物正向序列:5′-AAAGGCTAGGCGATCCCACA-3′,反向序列:5′-ACTCCCTAGCTTGGCTCTCCT-3′;LncRNA FAM72D-3引物正向序列:5′-GGAGGG CAGAAGGAAGAAAACAG- 3′,反向序列:5′-CACTGTCCGTCTGTATGCGAG-3′;GAPDH正向序列:5′-CGGACGACTCGGGATGAGA-3′,反向序列:5′-GAGAGCTGCACGATCCAGTTG-3′。反应条件:95 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。反应体系:SYBR Premix 10 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 2 μL和双蒸水 7 mL。以GAPDH为内参,血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3的表达采用2-ΔΔCt法表示。以LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3相对表达水平的平均值3.12,2.95作为临界值,分为LncRNA 00853高表达组(n=52)和LncRNA 00853低表达组(n=50),LncRNA FAM72D-3高表达组(n=49)和LncRNA FAM72D-3低表达组(n=53)。

1.4随访 所有患者确诊后开始进行随访,每3个月随访一次,以电话或门诊复查方式进行,连续随访3年,随访截止时间2022年7月1日,随访终点为患者死亡或随访时间结束。

2 结 果

2.1两组血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3相对表达水平比较 AFP-NHCC组血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3相对表达水平分别为3.12±0.86、2.95±0.78,明显高于对照组的1.22±0.36、1.16±0.28,差异有统计学意义(t=17.546、19.552,P<0.05)。

2.2血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3与AFP-NHCC患者临床病理特征的关系 血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3与AFP-NHCC患者BCLC分期、病理分化程度及肝内淋巴结转移有关(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤结节数目、包膜完整性无关(P>0.05),见表1。

表1 血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3与AFP-NHCC患者临床病理特征的关系

续表1 血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3与AFP-NHCC患者临床病理特征的关系

2.3血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3对AFP-NHCC患者生存预后的影响 AFP-NHCC组患者随访3～36个月,随访期间死亡32例,失访2例,中位生存时间为30.82个月(95%CI28.79～32.67)。LncRNA 00853高表达组患者中位生存时间为29.31个月(95%CI26.36～32.26)明显低于低表达组患者的32.41个月(95%CI32.55～34.51),差异有统计学意义(Log-rankχ2=4.844,P=0.028)。LncRNA FAM72D-3高表达组患者中位生存时间为30.43个月(95%CI27.81～33.04)明显低于低表达组患者的32.61个月(95%CI30.64～34.76),差异有统计学意义(Log-rankχ2=4.576,P=0.032)。见图1。

注:A为血清外泌体LncRNA 00853对AFP-NHCC患者生存预后的影响;B为LncRNA FAM72D-3对AFP-NHCC患者生存预后的影响。图1 血清外泌体LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3对AFP-NHCC患者生存预后的影响

2.4单因素及多因素Cox回归分析影响AFP-NHCC患者生存预后的因素 以AFP-NHCC患者的生存预后为因变量(死亡赋值为1、存活赋值为0),纳入年龄(≥60岁赋值为1、<60岁赋值为0),性别(男赋值为1、女赋值为0),肿瘤最大径(>5 cm赋值为1、≤5 cm赋值为0),肿瘤结节数目(≥2个赋值为1、<2个赋值为0),包膜完整性(不完整赋值为1、完整赋值为0),BCLC分期(B～C期赋值为1、0～A赋值为0),病理分化程度(低分化赋值为1、高中分化赋值为0),肝内淋巴结转移(有赋值为1、无赋值为0),LncRNA 00853(高表达赋值为1、低表达赋值为0),LncRNA FAM72D-3(高表达赋值为1、低表达赋值为0)为自变量,单因素及多因素Cox回归分析结果显示,BCLC分期B～C期、病理低分化程度、伴有肝内淋巴结转移、LncRNA 00853高表达及LncRNA FAM72D-3高表达是影响AFP-NHCC患者生存预后的独立危险因素。见表2、3。

表2 单因素Cox比例风险回归模型分析

续表2 单因素Cox比例风险回归模型分析

表3 多因素Cox比例风险回归模型分析

3 讨 论

HCC起病隐匿,发现时多为晚期,患者的临床预后较差。AFP是临床上HCC最常用的肿瘤标志物,不仅广泛用于HCC的早期筛查诊断,也普遍用于患者术后预后判断及肿瘤复发的监测[8]。但临床中发现,约30%的HCC患者AFP表达阴性(<20 μg/L),即AFP-NHCC患者,特别是在肿瘤最大径<5 cm的小肝癌患者中,AFP阳性率仅为25%[9]。目前用于AFP-NHCC患者预后评估系统包括BCLC系统及Child-Pugh系统等,BCLC系统评估内容涉及肿瘤负荷及血管淋巴管侵犯的情况等,虽然全面但过于复杂。Child-Pugh系统评估内容包括腹水及肝性脑病,不同医师的主观观测结果不同,对患者预后评估有较大差异[10]。因此,深入研究AFP-NHCC的疾病机制,寻找能够术前判断患者预后的肿瘤标志物,有利于对不同风险的AFP-NHCC患者进行个体化治疗,以改善临床预后。

外泌体是具有双层磷脂结构的微小囊泡,细胞可分泌产生外泌体,外泌体中含有蛋白、脂质及核酸等活性物质,具有细胞间通讯、免疫抗原呈递等多种生物学功能[11]。肿瘤细胞可分泌外泌体,并能分布到血液、尿液等体液中被检测到,检测外泌体中核酸分子如LncRNA等,可能是理想的肿瘤标志物[12-13]。LncRNA 00853是一种内源性长链RNA分子,位于染色体1p33上,具有较高的细胞和组织特异性,参与个体生长发育调控过程[14]。本研究中,AFP-NHCC组患者血清外泌体LncRNA 00853明显高于对照组,提示LncRNA 00853可能参与AFP-NHCC患者的肿瘤发生。既往有学者对HCC患者血清外泌体中LncRNA进行分析[6],也证实相比于健康人群血清,LncRNA 00853是差异性表达升高最明显的基因之一。目前AFP-NHCC中LncRNA 00853表达上调的机制尚不清楚,可能与RNA调控网络异常有关,研究发现,环状RNA能够作为内源竞争性RNA,结合并抑制LncRNA的表达及功能,环状RNA的表达失调可导致LncRNA 00853的表达升高,进而促进癌细胞生长、上皮间质转化和化疗耐药等过程[15]。本研究中,LncRNA 00853的表达与AFP-NHCC患者BCLC分期、病理分化程度及肝内淋巴结转移有关,提示LncRNA 00853的表达升高促进肿瘤的恶性进展。研究表明,LncRNA 00853通过促进CC趋化因子受体9的表达,通过结合CC趋化因子配体25,增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,导致肿瘤的进展[16]。本研究发现,血清外泌体LncRNA 00853高表达的AFP-NHCC患者生存预后较差,是影响患者生存预后的独立危险因素,表明检测血清外泌体中LncRNA 00853的表达有助于评估临床预后,是新的AFP-NHCC预后相关的生物标志物。研究表明,CC趋化因子受体9通过结合其特异性配体CC趋化因子配体25,激活Wnt/β-连环蛋白通路,增强肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性[17],LncRNA 00853可通过促进该通路的激活,导致患者不良生存预后[16]。

LncRNA FAM72D-3是近年来发现的新的RNA调控分子。体外细胞实验中发现,肝癌细胞系如HepG2,SNU-423中LncRNA FAM72D-3表达均明显升高,可能是新的HCC肿瘤标志物[7]。本研究中,AFP-NHCC患者血清外泌体中LncRNA FAM72D-3表达明显升高,并且与BCLC分期、病理分化程度及肝内淋巴结转移有关,提示LncRNA FAM72D-3表达升高参与促进AFP-NHCC的发生发展。研究发现,LncRNA FAM72D-3能够作为分子海绵结合并抑制miR-5787的表达[7],引起miR-5787的下游靶基因真核翻译起始因子5 mRNA的稳定性增加,促进肿瘤细胞增殖,迁移和转移能力[18-19]。本研究发现,LncRNA FAM72D-3高表达患者的生存预后较差,是影响AFP-NHCC患者生存预后的独立危险因素,表明血清外泌体LncRNA FAM72D-3是一种新的评估AFP-NHCC生存预后的肿瘤标志物。LncRNA FAM72D-3可通过影响下游微小RNA及靶基因的表达,影响肿瘤对化疗药物的耐药性,进而影响患者生存预后。有学者报道,LncRNA FAM72D-3的表达升高能够抑制miR-5787的表达,而miR-5787表达下调诱导线粒体细胞色素c氧化酶亚基3的表达,进而抑制肿瘤细胞氧化磷酸化,促进无氧糖酵解,增强肿瘤细胞对顺铂等化疗药物的耐药性,导致患者不良生存预后[20]。

综上所述,AFP-NHCC患者血清外泌体中LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3水平升高,其水平与AFP-NHCC患者BCLC分期、病理分化程度及肝内淋巴结转移有关,共同参与促进AFP-NHCC的肿瘤进展。血清外泌体中LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3高表达的AFP-NHCC患者生存预后较差,是影响患者生存预后的独立危险因素。但本研究仍然存在一定不足之处,由于样本量及随访时间有限,有待今后设计多中心临床试验进一步研究。