与食管癌淋巴结转移、肿瘤免疫细胞浸润有关预后的基因分析*

付 伟,程国彬,丁 瑶,张 鹤,邓亚婕,罗永婧

联勤保障部队第九二五医院消化内科,贵州贵阳 550009

食管癌是世界上最常见和最致命的消化系统肿瘤之一。在美国,每年有超过18 000人被诊断为食管癌,有超过15 000人死于食管癌,大多数患者在诊断后1年内死亡[1]。超过90%的食管癌患者病理类型是食管鳞状细胞癌(ESCC)[1-2]。尽管近年来中国食管癌的发病率有所下降,但由于人口众多,食管癌患者的绝对数量仍然很高。食管癌的主要治疗方法是手术、化疗和放疗。完整的手术切除和根治性淋巴结清扫可以提供准确的分期,目前食管癌患者的分类标准包括组织学分级、原发肿瘤、淋巴结转移等[3],对预测预后和确定术后治疗方案具有重要的指导意义。一个有效合理的食管癌分期系统对于治疗方案的选择和长期生存的预测具有重要意义[4-5]。

淋巴结转移是食管癌最关键的预后因素,淋巴结的数量与疾病的进展有关[4-5]。原发肿瘤和淋巴结扩散的程度决定了食管癌的预后,已有研究发现淋巴结状态是预测复发疾病及5年生存率的一个因素[5]。在食管癌中,需要一种预测生物标志物来确定疾病的进展和预后。本研究基于综合生物信息学分析,探索可能影响食管癌淋巴结转移的基因,并探讨其与免疫浸润的关系,以期为临床治疗食管癌淋巴结转移提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究使用了来自癌症基因组图谱(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库中食管癌的RNAseq数据集level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq数据和临床数据,FPKM格式的RNAseq数据转换成了TPM格式并进行log2转化,截止时间2021年3月31日。首先确定了食管癌患者,本研究共包括144个标本,包括66个无淋巴结转移的标本和78个有淋巴结转移的标本。

1.2淋巴结转移基因表达的差异 将来自TCGA数据库的食管癌标本数据分为两组,有淋巴结转移和无淋巴结转移。然后,使用R软件的Limma软件包研究mRNA的差异表达。当“调整的P<0.05和log2(倍数变化)>1.5或log2(倍数变化)<-1.5”被定义为阈值mRNA差异表达筛选。

1.3蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络结构 PPI淋巴结转移相关基因网络基于 metascape在线数据库(https://metascape.org/gp/#/main/step1)进行分析,采用mcode算法确定中心基因。

1.4免疫浸润评估 用于分析基因与免疫细胞浸润之间的关系。横坐标代表基因,纵坐标代表免疫细胞,相关系数范围为-1～1,负值代表呈负相关,正值代表呈正相关。

1.5基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析 采用GO富集分析生物过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF),采用rpackage簇图谱对筛选出的淋巴结转移相关基因进行KEGG分析。

1.6预后模型 对与淋巴结转移密切相关的基因进行预后模拟,采用LASSO Logistic回归分析获得最佳相关基因,确定与预后相关的基因,构建基因特征,并根据每例患者签名中基因的回归系数和相应的表达值计算风险评分。

1.7统计学处理 从TCGA中获得的统计数据采用R3.6.3软件包进行处理。灵敏度和准确性通过受试者工作特征(ROC)曲线来验证。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1分析淋巴结转移差异表达的基因 利用TCGA数据库研究发现,在有无淋巴结转移的食管癌中存在227个差异表达的基因,其中70个为上调基因,157个为下调基因。

2.2食管癌中表达的中枢(Hub)基因的PPI网络构建 通过分析食管癌有无淋巴结转移的差异表达基因,构建了70个上调和157个下调基因的PPI网络,并确定了31个Hub基因。另外,将基于TCGA数据集的食管癌标本按有无淋巴结转移分为两组,发现其中7个基因[甲状旁腺激素样激素(PTHLH)、C型凝集素域7家族成员A(CLEC7A)、胰高血糖素(GCG)、瞬时受体电位离子通道香草素亚型3(TRPV3)、松弛素家族肽受体4(RXFP4)、血小板因子4(PF4)、生长抑素受体(SSTR)5]的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

注:图中为前31个Hub基因,其高度较高的节点以红色、蓝色显示。图1 PPI网络建设图

注:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。图2 食管癌中淋巴结转移的7个Hub基因的表达

2.3GO富集分析和KEGG分析 结果表明,这些基因在G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶激活G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路、钙离子输入的正向调节、宿主细胞细胞质及神经活性配体-受体相互作用中发挥着重要的作用,见图3。

注:A为BP分析的圆图;B为CC分析的圆图;C为MF分析的圆图;D为KEGG分析图。图3 7个Hub基因的GO分析和KEGG分析

2.4食管癌中7个Hub基因与免疫浸润的关系 经过GO富集分析发现,GPCR家族在涉及信号转导的细胞膜受体中占据重要地位,参与调节免疫应答和炎症反应,并且在食管癌的免疫浸润中扮演着重要的角色。进一步分析食管癌基因与免疫浸润的关系发现,这7个基因与多种免疫细胞有关,其中PTHLH、CLEC7A、TRPV3与Tcm中央记忆型T细胞呈正相关,与Th17细胞、NK CD56 明亮细胞、嗜酸性粒细胞呈负相关;PF4、SSTR5、RXFP4与Tcm中央记忆型T细胞呈负相关,与Th17细胞、NK CD56明亮细胞、嗜酸性粒细胞呈正相关。见图4。

注:*P<0.05;**P<0.01。图4 食管癌中7个Hub基因与免疫浸润的关系

2.5预后建模 对来自食管癌队列的6个基因表达矩阵进行了LASSO Logistic回归分析,使用有无淋巴结转移来最终确定3个最相关的基因(GCG、TRPV3、SSTR5)构建体的风险评分,λ值最小目标参量均值=0.041,风险评分=0.064 7×GCG+0.082 2×TRPV3+0.092 9×SSTR5。见图5。

注:A为风险评分从低到高的散点图;B为不同标本风险评分对应的生存时间和生存状态的散点图分布及预后模型中基因表达的热图;C为高风险患者和低风险患者的Kaplan-Meier曲线;D为该风险模型的1、3、5年的ROC曲线。图5 预后风险模型的构建

2.6多因素Cox回归分析 进一步分析TCGA数据集中的风险模型,显示高危患者的生存状态低于低危患者,风险比(HR)为1.64,P=0.056。同时,该模型在1、3、5年的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.580、0.631和0.950。另外,对基于风险的评分公式中的基因进行了多因素Cox回归分析,表明SSTR5是独立的预后因素。见表1。

表1 多因素Cox回归分析

续表1 多因素Cox回归分析

3 讨 论

食管癌是一种常见的恶性肿瘤,预后差,长期生存率低。对于局部晚期可切除的食管癌,新辅助化疗目前是治疗的标准[6-8]。然而,无论进行何种根治性切除和扩大淋巴结清扫,大多数ESCC患者仍然死于局部区域复发和(或)远处转移。因此,食管癌的5年生存率仅在13%～18%[9],区域淋巴结转移是ESCC患者术后失败的主要标志[10]。有研究报道了miRNAs和长非编码RNA与ESCC转移的关系[11],表明淋巴结转移与特定生物标志物的异常表达之间存在直接联系。因此,有可能在术后通过检测特定的生物标志物来识别高危的淋巴结转移患者,从而精确地进行术后辅助治疗,提高生存率。

肿瘤细胞可通过系统循环迁移到区域淋巴结。几乎所有类型的癌症都涉及循环肿瘤细胞。淋巴结转移是乳腺癌、头颈部癌症、结直肠癌和前列腺癌的一个公认的预后因素。然而,在不同的癌症中,血管侵犯(淋巴侵犯、血源性传播等)的方法是不同的。HOSCH等[12]将食管癌归为免疫性肿瘤。WU等[13]报道的机制包括由于主要组织相容性复合体Ⅰ类表型食管癌的DNA甲基化对细胞毒性T淋巴细胞的功能性抑制而导致的免疫规避和高凝血。

因此,有必要寻找能够预测早期转移现象的生物标志物。在本研究中,在两组有无淋巴结转移的标本中检测到227个基因表达差异,70个上调基因和157个下调基因。然后,构建了这些基因的PPI网络,并筛选了总共7个Hub基因,包括PTHLH、CLEC7A、GCG、TRPV3、RXFP4、PF4、SSTR5。

研究发现,在ESCC的一个亚群中溴结构域睾丸特异性蛋白与鳞状细胞表型相关的关键ΔNp63靶基因PTHLH环路有关[14]。有研究发现, CLEC7A在胰腺导管腺癌(PDA)的巨噬细胞上高表达,靶向CLEC7A信号传导是开发PDA免疫疗法的潜在策略[15]。GCG是林奇综合征发展成结直肠癌的生物标志物[16]。在结肠癌中发现具有高预后价值的GCG异常表达。肿瘤进展相关的途径和肿瘤免疫调节细胞与GCG的表达有关。因此,GCG可被视为治疗结直肠癌的一个潜在治疗靶点。但是在食管癌的研究中相关报道较少[17]。有研究表明,SSTR在多肿瘤中过度表达,在食管腺癌患者中,大多数人表达少量的SSTR[18]。

淋巴结也是肿瘤转移的常见部位,淋巴结中的癌细胞可以通过控制免疫细胞的浸润和反应性来塑造它们与宿主免疫系统的相互作用。这可能表明淋巴结转移可能与免疫细胞的浸润密切相关。GO富集分析结果也显示了7个Hub基因和免疫之间的可能联系。本研究还分析了这些基因与食管癌免疫细胞浸润水平的相关性。免疫浸润分析结果显示,PTHLH、CLEC7A、TRPV3与Tcm中央记忆型T细胞呈正相关,与Th17细胞、NK CD56明亮细胞、嗜酸性粒细胞呈负相关;PF4、SSTR5、PXFP4与Tcm中央记忆型T细胞呈负相关,与Th17细胞、NK CD56明亮细胞、嗜酸性粒细胞呈正相关。

CLEC7A通过修饰肠道菌群来调控Treg细胞的分化,从而调节肠道免疫稳态[19]。SSTR5诱导SW480结肠癌细胞凋亡,促进β-catenin质膜积累,T细胞因子依赖的转录失活,下调Wnt靶基因cyclin D1和c-Myc[20]。这进一步证明免疫细胞浸润可以促进食管癌的淋巴结转移。结合这项研究可以看出,这一过程与这7个关键基因密切相关,但具体机制还有待研究。

最后,本研究对TCGA数据库中7个基因表达矩阵进行了LASSO Logistic回归分析,通过有无淋巴结转移来最终确定为3个最相关基因(GCG、TRPV3、SSTR5)构建的风险评分。此外,基于风险评分公式中变量Cox回归分析显示,SSTR5是独立的预后因素。这可以解释GCG、TRPV3、SSTR5与食管癌淋巴结转移的预后密切相关。

但本研究存在一定局限性:(1)TCGA是一个定期更新的公共数据库,但样本量和数据量有限,临床病理信息不全面,这可能会导致一些潜在的错误或偏见,未来应该包括更多的数据来改进模型;(2)缺乏体内和体外实验的验证。本课题组还将继续进行基因对相应免疫细胞调节机制的研究。

综上所述,食管癌中有7个基因与淋巴结转移有关。此外,GCG、TRPV3、SSTR5与食管癌淋巴结转移的预后密切相关。上述7个基因可能通过免疫细胞浸润促进食管癌的淋巴结转移,但其具体机制仍有待研究,这也为免疫疗法阻止食管癌的进展提供了潜在的方向。