薯蓣皂苷元通过激活VIP/cAMP/PKA通路改善慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症和肺损伤

甘 平,黄 颖

武警重庆总队医院:1.呼吸与危重症医学科;2.老年科,重庆 400061

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以慢性支气管炎症和肺气肿胀为特征的疾病,最终可导致肺心病和呼吸衰竭[1]。COPD是世界范围内导致死亡的第4大死因,据统计10%的成年人受COPD的影响[2]。由于人们对COPD发病机制认识比较匮乏,尚未找到有效的治疗措施。薯蓣皂苷元为盾叶薯蓣等根茎提取物,是制备甾体激素类药物的重要原料,具有抗凋亡、抗血栓、保护心脏等作用[3-4]。薯蓣皂苷元可通过作用于炎症通路,减轻哮喘、关节炎等炎症性疾病的病理进展[5]。而关于薯蓣皂苷元对COPD大鼠气道炎症和肺损伤的影响报道较少。另外,有研究表明通过调控蛋白激酶A(PKA)通路可对COPD起到一定的改善作用[6]。因此,本研究从血管活性肠肽(VIP)/环磷酸腺苷(cAMP)/PKA通路出发,初步探究薯蓣皂苷元对COPD大鼠的影响并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 60只SPF级6周龄雄性SD大鼠购自中国科学院动物研究所[许可证号:SCXK(京)2021-0012],体重(200±10)g。本研究已获得本院伦理委员会的批准。

1.2仪器与试剂 荧光显微镜购自日本Olympus公司,ELX800多功能酶标仪购自美国Biotek公司。薯蓣皂苷元(货号:PCS0224)购自成都植标化纯生物技术有限公司,地塞米松(货号:H20052187)购自沈阳光大制药有限公司,VIP/cAMP/PKA通路抑制剂H89(货号:HY-15979A)购自美国MCE公司,脂多糖(货号:SC00653)购自北京凯诗源生物科技有限公司,白细胞介素(IL)-6(货号:FY-A014251)、IL-8(货号:FY-A014238)、cAMP(货号:DS-110)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海富雨生物科技有限公司,肿瘤坏死因子-α(TNF-α,货号:Y102928)ELISA试剂盒购自上海易汇生物科技有限公司,VIP(货号:ab85556)、PKA(货号:ab32390)、IL-17-PE抗体(货号:ab108596)、CD4-APC(货号:ab252152)均购自英国Abcam公司,FOXP3-PE(货号:NB100-39002PE)购自英国Biorbyt公司。

1.3COPD大鼠模型构建及实验分组 参考文献[7],使用气道内滴注脂多糖联合烟熏4周构建COPD大鼠模型。若大鼠0.3 s用力呼气量和用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)和呼气峰流速(PEF)与对照组比较明显降低,则造模成功。对照组不做滴注脂多糖和烟熏处理。

将造模成功的48只SD大鼠随机分为模型组、薯蓣皂苷元组、阳性组、薯蓣皂苷元+H89组,每组12只。薯蓣皂苷元组按照100 mg/kg的剂量灌胃薯蓣皂苷元[8],阳性组按照0.81 mg/kg的剂量腹腔注射地塞米松[9],薯蓣皂苷元+H89组在薯蓣皂苷元组基础上按照1 mg/kg腹腔注射H89[10],对照组和模型组给予等体积生理盐水,每周1次,持续4周。

1.4标本采集 末次给药后,尾静脉采血、静置、分离得到血清。麻醉大鼠后处死,分离肺组织,左肺固定于4%多聚甲醛中,右肺用于ELISA、流式细胞术、实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白质印迹法(Western blot)实验。

1.5肺功能检测 将大鼠放进体积描记箱后,开启全身体积描记系统和数据分析系统,待数据稳定后记录FVC、PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC。

1.6ELISA检测 取上述分离得到的血清,按照ELISA试剂盒说明书检测血清IL-6、IL-8、IL-7、TNF-α水平及肺组织cAMP水平。

1.7肺组织形态观察 取多聚甲醛中的肺组织,经脱水、浸蜡、包埋、切片、制片等一系列步骤后,用苏木精和伊红染色后,在光学显微镜下观察肺组织的形态并进行评分。

1.8流式细胞术检测肺Th17、Treg细胞比例 分离肺组织的淋巴细胞,加入缓冲液使细胞浓度稀释到每毫升1×106个,与CD4-APC、IL-17-PE避光孵育20 min,以CD4+IL-17+表示Th17细胞数量,另外与CD4-APC、FOXP3-PE避光孵育20 min,以CD4+FOXP3+表示Treg细胞数量。

1.9Western blot检测VIP、PKA蛋白表达 取大鼠肺组织匀浆,用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白,蛋白质经过变性、定量、电泳、转膜等一系列步骤,封闭3 h后分别加入一抗VIP(1∶1 000)、PKA(1∶2 000)、磷酸化PKA(p-PKA,1∶2 000)和GAPDH抗体(1∶1 000),4 ℃孵育过夜;加入HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶3 000),室温孵育2 h,加入ECL试剂显影后。使用Image LabTM软件分析目标蛋白的灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠肺功能比较 与对照组比较,模型组大鼠FVC、PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC降低(P<0.05);与模型组比较,薯蓣皂苷元组、阳性组大鼠FVC、PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC升高(P<0.05);与薯蓣皂苷元组比较,薯蓣皂苷元+H89组大鼠FVC、PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC降低(P<0.05)。见图1。

注:A为各组FVC比较;B为各组PEF比较;C为各组FEV0.3比较;D为各组FEV0.3/FVC比较;与对照组比较,aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05;与薯蓣皂苷元组比较,cP<0.05。图1 各组大鼠肺功能比较

2.2各组大鼠血清炎症因子水平比较 与对照组比较,模型组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17水平升高(P<0.05);与模型组比较,薯蓣皂苷元组、阳性组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17水平降低(P<0.05);与薯蓣皂苷元组比较,薯蓣皂苷元+H89组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清炎症因子水平比较

2.3各组大鼠肺组织病理学变化 对照组大鼠肺组织结构正常,肺泡结构完整正常。与对照组比较,模型组大鼠有炎症细胞浸润、部分血管破裂等损伤,炎症评分升高(P<0.05);与模型组比较,薯蓣皂苷元组、阳性组大鼠上述损伤缓解,炎症评分降低(P<0.05);与薯蓣皂苷元组比较,薯蓣皂苷元+H89组大鼠肺损伤加重,炎症评分升高(P<0.05)。见图2、表2。

表2 各组大鼠肺组织炎症评分比较

注:A、B、C、D、E分别为对照组、模型组、薯蓣皂苷元组、阳性组、薯蓣皂苷元+H89组肺组织形态图。图2 大鼠肺组织形态观察(HE染色,×200)

2.4各组大鼠肺Th17/Treg细胞水平比较 与对照组比较,模型组大鼠肺Th17细胞水平及Th17/Treg升高(P<0.05),Treg细胞水平降低(P<0.05);与模型组比较,薯蓣皂苷元组、阳性组大鼠肺Th17细胞水平及Th17/Treg降低(P<0.05),Treg细胞水平升高(P<0.05);与薯蓣皂苷元组比较,薯蓣皂苷元+H89组大鼠肺Th17细胞水平及Th17/Treg升高(P<0.05),Treg细胞水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肺Th17、Treg细胞水平比较

2.5各组大鼠肺组织VIP、cAMP、PKA水平比较 与对照组比较,模型组大鼠肺组织VIP、cAMP水平及p-PKA/PKA降低(P<0.05);与模型组比较,薯蓣皂苷元组、阳性组大鼠肺组织VIP、cAMP水平及p-PKA/PKA升高(P<0.05);与薯蓣皂苷元组比较,薯蓣皂苷元+H89组大鼠肺组织VIP、cAMP水平及p-PKA/PKA降低(P<0.05),见图3、表4。

表4 各组大鼠肺组织中VIP、cAMP、PKA水平比较

图3 Western blot检测肺组织VIP、PKA蛋白表达

3 讨 论

COPD由慢性异常肺部炎症反应引起,受遗传和环境因素等影响[11]。长期吸烟是造成肺部炎症的重要原因之一[12],因此,本研究采用烟雾和脂多糖诱导构建COPD大鼠模型,结果发现与对照组比较,模型组大鼠FVC、PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC降低,与先前的研究结果一致[7],表明COPD模型构建成功。薯蓣皂苷元是一种植物化学物质,因其在抗炎、抗高血脂、抗凋亡、抗感染等方面起到积极作用,而被广泛应用于临床[13-14]。研究表明,薯蓣皂苷元可以抑制癌症、皮肤病、心血管疾病、动脉粥样硬化和骨质疏松症等疾病的进展[15]。本研究结果显示,薯蓣皂苷元组大鼠肺组织损伤缓解,炎症评分明显升高,暗示薯蓣皂苷元对COPD大鼠肺部炎症和损伤起到一定改善作用。

Th17/Treg平衡在慢性炎症疾病的发生中起着关键作用,Th17细胞可以促进炎症反应的发生,使血管内皮细胞损伤、肺部出现水肿。而Treg可以释放多种细胞因子,抵抗炎症反应,使机体的免疫系统保持稳定[16]。抑制Th17细胞可以减轻机体的炎症反应,对COPD患者起到改善作用[17]。研究报道称IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17等可诱导组胺释放和中性粒细胞分解,促进其他炎症介质的浸润和释放,诱发组织纤维化,加重肺功能损伤,促进COPD的发展[18]。本研究发现模型组大鼠较对照组IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17、Th17细胞水平、Th17/Treg升高,Treg细胞水平降低,表明COPD大鼠存在以Th17细胞为优势的炎症反应。而薯蓣皂苷元明显降低了IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17、Th17细胞水平及Th17/Treg,升高了Treg细胞水平,提示薯蓣皂苷元可能通过调节Th17/Treg平衡,降低IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17等炎症介质水平,缓解COPD大鼠的炎症损伤。

VIP是一种免疫反应性神经肽,可以抵抗炎症反应的发生。有报道称VIP激活剂可以缓解慢性支气管炎和肺纤维化[19]。cAMP是组织和细胞代谢过程中的重要物质,VIP可以通过与G蛋白偶联跨膜受体结合促进cAMP释放,cAMP可以促使PKA磷酸化,从而使VIP/cAMP/PKA通路活化[20]。研究发现,激活VIP/cAMP/PKA通路可以减轻炎症反应、改善血管内皮损伤和肺功能损伤[19,21]。本研究发现,模型组大鼠VIP、cAMP水平及p-PKA/PKA较对照组降低,而薯蓣皂苷元组大鼠VIP、cAMP及p-PKA/PKA较模型组升高,推测薯蓣皂苷元可能通过激活VIP/cAMP/PKA通路,改善COPD大鼠气道炎症和肺损伤。为了验证该推测,本研究利用VIP/cAMP/PKA通路抑制剂H89进行干预,结果发现,与薯蓣皂苷元组比较,薯蓣皂苷元+H89组肺损伤加重,炎症评分、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17、Th17细胞水平、Th17/Treg均升高,肺功能、Treg细胞水平、VIP、cAMP水平及p-PKA/PKA降低,表明H89可减弱薯蓣皂苷元对COPD大鼠气道炎症和肺损伤的改善作用。

综上所述,薯蓣皂苷元可能通过激活VIP/cAMP/PKA通路对COPD大鼠气道炎症和肺损伤起到一定的缓解作用。此外,本研究发现阳性组与薯蓣皂苷元组效果一致,可为治疗COPD提供数据参考及潜在治疗药物。然而,薯蓣皂苷元的治疗靶点可能涉及其他通路,有待后续进一步探究。