骨碎补总黄酮对乳牙牙髓干细胞增殖及成骨向分化的影响

李春梅，高艳宇，李慧

黑龙江省医院口腔科，黑龙江哈尔滨 150001

乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoli⁃ated deciduous teeth，SHEDs）是一种外胚层来源的间充质干细胞，除了具有多向分化潜能及低免疫原性外，还表现出极强的增殖能力和成骨分化效率，在骨组织工程领域中备受青睐[1-3]。骨碎补总黄酮（total flavone of rhizoma drynariae，RDTF）是从百合科植物黄精中提取到的一种活性成分，可以从阻碍破骨细胞产生和促进新骨形成两方面增进骨骼健康[4-5]。关于RDTF对SHEDs的功能调控作用尚未见相关报道。本实验通过探究不同浓度RDTF对SHEDs增殖和成骨分化潜力的影响，2020年3月—2021年8月黑龙江省医院检验科初步筛选出适宜浓度的RDTF，为实现SHEDs在骨缺损修复的临床应用提供实验基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

抗坏血酸（北京索莱宝），RDTF（西安杨凌慈缘）、CCK-8试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒（上海碧云天），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hy⁃Clone，美国）

1.2 方法

1.2.1 SHEDs的分离与培养 本研究经患者及家属知情同意，收集口腔科因乳牙滞留而拔除的乳牙样本，要求牙齿无明显病变，牙根吸收小于1/2。4 h内在无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓，用含2%青-链霉素双抗的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered so⁃lution，PBS）反复冲洗并充分剪碎，待细胞生长至80%融合时，用胰蛋白酶消化后传代培养。收集对数期生长的3~5代细胞用于后续实验。

1.2.2 SHEDs的鉴定 SHEDs消化重悬，取细胞悬液以1×106个/管加入待测样本管中。使用人间充质干细胞( mesenchymal stem cells, MSC)表面标记检测试剂盒对SHEDs进行鉴定，按照说明书进行操作。

1.2.3 钙钴法染色 将SHEDs以1×105个/孔到接种到6孔板上，用成骨诱导培养液为溶剂，配置0、12.5、25、50 mg/L RDTF的培养液。实验共分为4组，（0时段为对照组，24、48、72 h组）每组设置3个复孔，连续培养7 d后进行检测。双蒸水润洗，倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.4 Western blot 实验分组及成骨诱导步骤同1.2.3。分别加入骨转录因子2(runt-related transcrip⁃tion factor 2, Runx2)、骨钙素(osteocalcin, OCN）和β-ac⁃tin一抗（按1∶2 000稀释），4℃孵育过夜，PBS清洗，加二抗（按1∶10 000稀释），室温孵育1 h，PBS清洗，用化学发光试剂盒显色后，将膜置于凝胶成像系统中观察显影，Image J软件分析灰度值。

1.3 观察指标

统计分析碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）。

1.4 统计方法

应用GraphPad Prism 5统计学软件对数据进行分析，计量资料经检验符合正态分布，以（）表示，采用t检验；多重比较方差齐性时用各研究组分别与对照组进行两两比较，采用Dunnett-t检验；方差不齐时采用Dunnett-T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SHEDs分离培养情况

成功分离培养SHEDs。镜下观察，大部分原代细胞在培养第3天贴壁生长，第7天可见克隆细胞团形成，细胞呈集落状生长，胞体短小呈梭形，胞核较大呈圆形，第10天后细胞生长达到一定融合度。进行传代培养后，第一代细胞迅速增殖，密度增大，形态以纺锤形和长梭形为主，呈旋涡状生长。见图1。

图1 SHEDs的培养（×100）

2.2 SHEDs的鉴定结果

SHEDs扩增培养至第3代，流式细胞仪对其表面抗原物质的表达进行鉴定。检测结果显示，间充质干细胞标志物CD73、CD90及CD105表达率高于99%，造血干细胞及单核细胞标志物CD34、CD19、CD45、CD11b及HLA-DR总体表达率低于1%（图2A）。成骨诱导21 d后，茜素红染色后可见细胞间橙红色矿化结节（图2B）。

图2 SHEDs的鉴定

2.3 RDTF对SHEDs ALP染色及ALP活性的影响

以含有12.5、25、50 mg/L RDTF的为研究组，以不含RDTF的为对照组在细胞成骨诱导培养的第7天，钙钴法检测ALP染色结果显示：各组在镜下能观察到黑棕色的染色结节，与对照组相比，25 mg/L RDTF组形成的染色结节数目最多，面积最大，其次是12.5 mg/L RDTF组（图3）。

图3 不同浓度RDTF对SHEDs ALP染色结果

成骨诱导7 d后，ALP 活性定量检测结果显示：与对照组相比较，12.5、25 mg/L RDTF 组 ALP 活性均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），其中25 mg/L RDTF 组ALP值的提升更为显著，见表1。

表1 RDTF对SHED ALP 活性的影响()

表1 RDTF对SHED ALP 活性的影响()

注：与对照组比较，*P<0.05

组别对照组（n=3）12.5 mg/LRDTF 组（n=3）25 mg/L RDTF 组（n=3）50 mg/L RDTF 组（n=3）F值P值7 d ALP 表达量254.896±4.573（308.756±10.369）*（332.313±7.373）*249.660±14.061 52.038<0.001

3 讨论

在探讨SHEDs成骨分化的研究中，首先要验证RDTF对SHEDs生长状况的影响。因此，本研究采用CCK-8法检测细胞增殖情况，结果显示各组光密度（optical density, OD）值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示一定浓度范围内的RDTF对SHEDs的增殖能力无显著影响，这与庞真贞等[6]，杜志豪等[7]学者的研究结果，OD值在第6天达到高峰值(OD值=0,43)一致。因此确定设置此干预浓度范围，进行后续成骨实验的研究。ALP作为成骨细胞分化早期的标志物之一，有学者报道代表着细胞外基质的成熟程度（ALP=3.324 mmol/L）[8]。它在一定程度上可以反映出细胞的成骨分化能力，其活性升高则代表骨矿化过程处于活跃阶段。庞真贞等[6]研究报道Runx2是重要的转录因子，在细胞成骨分化的早期阶段起到关键的调节作用，PCR结果显示Runx2表达最高为25 mmol/L[9]。Runx2的表达标志着成骨细胞开始分化，目前已被证实可以诱导成骨相关基因OCN的表达。Moghadam FH等[10]报道OCN是成骨细胞向新骨形成过程的特异性指标，当细胞进入成骨分化晚期即矿化期，PCR结果显示OCN为40 mmol/L其表达到达高峰(2.332 mmol/L)。OCN主要由成骨细胞合成分泌至细胞外基质中，不仅起到结构支撑作用，还在骨钙代谢过程中起重要调节作用，加速基质矿化。本研究从蛋白水平对SHEDs早期及晚期的成骨分化能力进行检测，结果显示，在成骨诱导14 d后，12.5、25 mg/L RDTF组均能上调Runx2及OCN的蛋白表达，其中25 mg/L RDTF组的Runx2及OCN蛋白表达水平（332.313±7.373）呈显著上调趋势，这与Huang Y等[11]研究的RDTF对恒牙牙髓干细胞的诱导作用（浓度为50 mg/L表达123·213 mg/mmol）不一致，本研究作用更明显，这可能是乳牙牙髓干细胞活性更强的原因。ALP 作为成骨细胞分化早期的标志物之一，代表着细胞外基质的成熟程度。骨形成的关键在于羟基磷灰石的沉积，其过程不仅有游离磷酸的参与，同时又受到焦磷酸盐抑制局部矿化能力的影响[12]。本研究在早期对ALP活性进行了定量检测，结果显示：12.5和25 mg/L PSP组的ALP的表达均显著提升(P<0.05)。而较高浓度（50 mg/L）PSP组与对照组相比，其ALP活性未见明显升高。钙钴法染色的ALP定性实验结果也印证了这一结论，这与Zhai Q等[13]研究报道的对牙周膜干细胞培养的结果相吻合（结果为16.231 mg/mmol）。Runx2是成骨分化中最早必不可少的特异性标志基因，其表达标志着SHEDs开始向成骨细胞分化和成熟[14]。研究结果表明，一定浓度的PSP对SHEDs的成骨分化具有促进作用，这与Peng X等[15]研究的其他中药作用并不一致（结果为11.4 mg/L），可能是因为药理作用不同而导致。体内研究还需进一步研究证实。

综上所述，骨碎补总黄酮对乳牙牙髓干细胞增殖及成骨向分化有增强作用，可为乳牙牙髓干细胞治疗骨质疏松提供理论基础和依据，为临床应用提供参考。