恩替卡韦联合聚乙二醇干扰素抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者HBV-RNA水平的影响

马超，曾明辉，黄玉贤，张钰斌，邱少霞，范红顺

粤北第二人民医院感染科，广东韶关 512028

慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。目前，我国约有7 000万例HBsAg携带者，其中CHB患者为2 000~3 000万例[1-2]。CHB患者肝组织内ccc-DNA的持续存在是CHB难以治愈且停药后易复发的主要原因[3]。1984年，Miller等首次观察到与DNA杂合的HBV-RNA；1996年，德国学者Köck证实了慢性HBV感染者的血清中存在多聚腺苷酰（polyA）化的HBV-RNA。2016年，证实血液中HBV-RNA的主要来源为未经逆转录的HBV pgRNA。HBV-RNA作为新的病毒学指标近年得到更多关注，2019年以来我国、欧洲及美国肝病学会均推荐其作为cccDNA存在和转录活性的指标[4-6]。肝组织ccc-DNA的检测需要肝活体组织检查，因为是有创检查，推广受限，而血清HBV-RNA水平可反映肝组织内ccc-DNA的活性，并与患者病毒学应答和预后有关[7-8]。

目前，PEG-IFN-α治疗下血清HBV-RNA可否准确反映cccDNA的水平及其转录活性，仍需进一步明确。基于此，本研究以2021年1月—2022年6月粤北第二人民医院收治的恩替卡韦口服1年以上HBV-RNA阴性的39例慢乙肝患者为研究对象，加用聚乙二醇干扰素α-2b联合原有的恩替卡韦治疗24周后，测定CHB患者的血清HBV-RNA水平，分析其与各临床指标的相关性，旨在为将HBVRNA作为CHB治疗评估的新型病毒学指标提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入本院收治的39例慢性乙型肝炎患者，平均年龄（49.1±10.7）岁；男29例，女10例；HBeAg阳性3例，HBeAg阴性36例。本研究得到医院医学伦理委员会的批准，患者均在充分了解研究计划后签署了知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①符合2019年版慢性乙型肝炎相关诊断标准；②患者已连续服用恩替卡韦（国药准字20100129）0.5 mg ，1次/d 1年以上，间隔3个月以上两次经罗氏Cobas试剂检测，均证实高敏HBV-DNA<20 IU/mL；③知情同意加用聚乙二醇干扰素α-2b 180 µg或135 µg，皮下注射，1次/周，联合原有的恩替卡韦口服，抗病毒治疗24周。

排除标准：①重叠甲型肝炎病毒（hepatitis A vi⁃rus，HAV)、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）等其他嗜肝病毒感染；②合并有人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染；③合并有药物性肝病、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎等其他肝损害病因；④肝恶性肿瘤。

1.3 方法

依据HBV-RNA阴性或阳性分组。所有患者均进行血常规、肝功能、HBV血清标志物、HBV-RNA、肝脏彩超等检测。高敏HBV-RNA检测采用罗氏诊断COBAS试剂，检测下限20 IU/mL。乙肝五项血清标志物（hepatitis B virus serum markers，HBV-M），采用乙型肝炎诊断试剂盒，以化学发光法进行检测，其中乙肝表面抗原定量（quantification of hepatitis B sur⁃face antigen，qHBsAg），参考值范围为0~0.05 IU/mL，有效检测范围0.05~250.00 U/mL，乙肝病毒e抗原（hepa⁃titis B e antigen，HBeAg）参考值范围为0~0.1 IU/mL。肝功能指标的检测，采用贝克曼680全自动生化分析仪。以血清丙氨酸氨基转移酶（alanine amino⁃transferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）作为观察指标。

HBV-RNA检测采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术（simultaneous amplification and testing，SAT）配套仪器为AutoSAT全自动核酸检测分析系统，原理为HBV特异性RNA寡核苷酸磁珠微粒提取靶标RNA，MMLV酶逆转录靶标RNA为cDNA，T7 RNA聚合酶转录cDNA，合成大量可检测的RNA负链，用含荧光和淬灭基团的RNA分子信标进行检测。检测过程无需DNA酶处理、并采用内标定量，样本的提取、洗涤、扩增、检测及定量结果均由配套仪器完成。通过HBV-RNA阴性、弱阳性、强阳性人血清稀释样本建立检测线性范围和标准曲线，得到每个样本HBV-RNA的浓度。检测下限50 copies/mL，线性范围2~8 log copies/mL。

1.4 统计方法

采用SPSSAU在线统计学软件进行数据处理。将HBsAg定量及HBV-RNA检测结果进行对数转换。符合正态分布的计量资料以（）表示，比较采用t检验。计数资料以例数和百分数（%）表示，比较采用χ2检验。HBV-RNA与HBeAg及qHBsAg水平之间的相关性采用Pearson相关系数（r）分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较

据患者血清HBV-RNA是否可检出分为两组，RNA阴性患者18例为A组，占比46.2%，其中HBeAg阴性18例，HBeAg阳性0例；男4例，女14例。RNA阳性患者21例为B组，占比53.8%，其中HBeAg阴性18例，HBeAg阳性3例（HBV-RNA均为阳性）；男6例，女15例。两组临床资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 两组患者临床资料比较()

表1 两组患者临床资料比较()

项目ALT（U/L）AST（U/L）PLT（×109/L）年龄（岁）A组（n=18）32.56±14.13 29.11±10.13 170.17±48.91 52.50±12.09 B组（n=21）38.67±35.56 33.57±22.52 163.29±69.28 46.29±8.72 t值-0.724-0.775 0.362 1.859 P值0.476 0.443 0.720 0.071

2.2 两组HBsAg定量水平比较

A组的HBsAg定量水平低于B组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图1。

图1 HBsAg在HBV-RNA分组中的分布箱线图

表2 HBV-RNA阴性和阳性组HBsAg的比较[()，IU/mL]

表2 HBV-RNA阴性和阳性组HBsAg的比较[()，IU/mL]

项目log10（HBsAg）A组（n=18）1.29±1.30 B组（n=21）2.66±0.65 t值-4.053 P值<0.001

2.3 HBV-RNA与临床特征相关性分析

CHB患者血清HBV-RNA可测与qHBsAg（r=0.485，P=0.002）、HBeAg（r=0.387，P=0.015）呈中等程度正相关。与ALT、AST、PLT、年龄、性别等变量无相关关系，见表3。

表3 HBV-RNA与临床特征相关性分析

2.4 CHB患者血清HBV-RNA水平的影响因素分析

分别以年龄（赋值：连续性变量）、性别（赋值：男=1，女=2）、ALT（赋值：连续性变量）、AST（赋值：连续性变量）、qHBsAg（赋值：对检测结果进行对数转换）、HBeAg定量为自变量，以血清HBV-RNA为因变量[赋值：对检测结果进行对数转换，即log（HBV-RNA），连续性变量]，进行多因素线性回归分析。结果显示，qHBsAg是CHB患者血清HBVRNA水平的影响因素（P<0.05），见表4。

表4 CHB 患者血清HBV-RNA水平的影响因素线性回归分析结果（n=39）

3 讨论

既往研究显示：核苷酸类似物（NAs）抗病毒治疗前，HBV-RNA与HBV-DNA、HBsAg、HBcrAg（乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原）均呈正相关，HBeAg阳性患者则更明显[9-10]。NAs抗病毒治疗后与HBV-DNA和HBsAg相关性会逐渐下降甚至消失，但与HBcrAg之间始终保持较好的相关性。接受长效干扰素治疗的患者，HBV-RNA与DNA、HB⁃crAg在治疗前后均具有良好的相关性，但治疗后与HBsAg的相关性明显减弱，甚至失去相关性。

那么，同时接受NAs和长效干扰素治疗的患者，HBV-RNA的特点及能否用来预测抗病毒治疗效果或指导NAs停药，这方面的资料较少，通常，选择NAs可强效抑制病毒复制，促进HBV-DNA转阴，而NAs+peg-IFN联合治疗后，可促进HBsAg下降，治疗前HBsAg低水平（<1 500 IU/mL）及治疗中HB⁃sAg快速下降（12周或24周时HBsAg<200 IU/mL或下降>1 lg IU/mL）的患者，联合治疗后HBsAg阴转的发生率较高[11]。

本研究纳入经过NAs抗病毒治疗后，HBV DNA已转阴，且愿意继续加用长效干扰素的患者为研究对象，入组人群中绝大多数已实现HBeAg血清学转换。通过测定HBV-RNA水平，并考察HBV-RNA与其他临床指标的相关性。本研究提示，经过序贯联合治疗后，HBV-RNA与qHBsAg、HBeAg仍具有中等程度相关性（r=0.485、0.387，P<0.05）。本研究发现，经过口服核苷（酸）类似物恩替卡韦治疗后，HBV-DNA和HBeAg双转阴的患者占比达92.3%（36/39），HBV-DNA和HBeAg双阴性患者中却仍有61.1%（22/36）的患者HBV-RNA仍可检出，且3例HBeAg阳性患者HBV-RNA均为阳性。箱线图提示HBV-RNA与HBsAg水平密切相关，表面抗原滴度低于10 IU/mL者（HBsAg<1log)，HBV-RNA检测值均为阴性；而HBV-RNA转阴的患者，HBsAg整体水平较低，多在2.5log以下（见图1）。

李小鹏等[12]选取70例高敏HBV-DNA检测均为阴性的CHB患者，发现58例患者血清HBV-RNA仍为阳性，达到（2.7±1.1）log copies/mL，血清HBVRNA水平与HBeAg 水平呈显著正相关（r=0.467，P=0.01），但与qHBsAg水平无显著相关（r=0.146，P=0.275）。本研究发现，qHBsAg及HBeAg均是CHB患者血清HBV-RNA水平的影响因素，CHB患者血清HBV-RNA可测与HBsAg（r=0.485，P=0.002）、HBeAg（r=0.387，P=0.015）中等程度相关，进一步的线性回归分析仅显示qHBsAg为影响因素，可能与入组患者中HBeAg阳性例数较少有关，二者相关性尚待进一步更大样本量的研究证实。

NAs停药后临床复发的预测一直是关注的热点。基于目前国内外指南推荐的停药标准[1,13-14],联合HBV-RNA指标可进一步降低停药后复发风险。然而，研究表明即使血清HBV-RNA转阴，也仍有部分患者存在复发风险，可见仍未真正达到“安全”停药之目标。2020年南方医科大学的研究团队发现，联合血清HBV-RNA及其他指标可以进一步降低停药后临床复发率[15]。基于既往停药标准（HBV-DNA和HBeAg转阴），NAs停药后4年累积临床复发率高达30.8%，通过联合HBV-RNA，NAs停药后4年累积临床复发率降至15.3%；而进一步联合HB⁃crAg，4年累积临床复发率则为0%。这项研究提示将HBV-RNA、HBcrAg两个指标联合用于预测NAs停药后的临床复发大有可为。2021年香港大学袁孟峰教授团队发表在GUT杂志上的一项研究，发现停药时HBV-RNA阴性+HBsAg<10 IU/mL的患者，NA停药后1年累积病毒学复发率为9.1%，显著低于单独使用HBV-RNA或HBsAg水平指导停药的患者（分别为36%~52%和36.7%）[16]。本研究证实，HBsAg低于10 IU/mL的患者，HBV-RNA一般呈阴性，故也可指导没有条件行HBV-RNA检测的地区或患者，若有强烈停药意愿，也可通过对HBsAg定量检测的充分评估，尝试停药。而HBV-RNA阳性组同时也伴有高水平的HBsAg（平均值2.5log），与我国专家共识一致[9]：对于符合现行停药标准的接受巩固治疗的患者，若血清HBV-RNA检测阳性，停药后疾病复发风险较大，不建议停药。

综上所述，经过NAs及peg-IFN-α序贯治疗后，HBV-DNA阴性的CHB患者血清HBV-RNA水平存在较大差异，HBeAg、qHBsAg与血清HBV-RNA水平具有相关性，且qHBsAg是CHB患者HBV-RNA低于检测下限的影响因素。研究显示，低水平HB⁃sAg（<10 IU/mL）多提示HBV-RNA阴性，CHB患者血清HBV-RNA水平在一定程度上可反映cccDNA转录活性，今后有望指导NAs停药。本研究仍有着局限。没有联合干扰素前的HBsAg定量及HBVRNA资料，难以比较其动态变化。样本量较少，HBeAg阳性的患者较少。之后将在下一步的工作中，通过更完善的研究设计，加以改进，以进一步探索HBV-RNA的预测效能。