癌基因纺锤体与着丝粒相关蛋白3（SKA3）在非小细胞肺癌增殖调控中的作用及机制

李明，刘景亮，申倩，李晓峰，张强

1.山东省公共卫生临床中心胸外科，山东济南 250000；2.山东省公共卫生临床中心病理科，山东济南 250000；3.山东省公共卫生临床中心骨科，山东济南 250000

肺癌是目前全球最常见和致死率最高的恶性肿瘤。肺癌在我国男性中是发病第一位的癌症，非小细胞肺癌是肺癌中最为常见的类型，占所有肺癌病例的85%~90%。抑制与预防非小细胞肺癌转移的研究具有重要意义[1-2]。相关研究内容显示，纺锤体与着丝粒相关蛋白3（spindle and kinetochoreassociated protein 3，SKA3）对动粒-微管之间的相互影响有直接介导作用，同时还可以进行细胞增殖以及细胞凋亡的调节[3-4]。SKA3经过大量研究已经被证实了可在肝癌、结肠癌、前列腺癌以及膀胱癌等病变中有高表达，影响了肿瘤的恶化和转移[5-6]。然而，非小细胞肺癌中SKA3的详细功能和潜在机制仍然存在很大程度的未知。本研究收集山东省公共卫生临床中心病理科2019年1—12月检验的60例非小细胞肺癌组织蜡块标本作为研究对象，进一步验证SKA3在非小细胞肺癌中的表达情况及其与患者预后的关系，探索SKA3在非小细胞肺癌细胞株中的生物学功能状态。从而可以证实SKA3基因可在非小细胞肺癌等疾病的恶性生物学行为中作为一种关键分子标记物参与并发挥调节作用，检测SKA3可以预测患者靶点，进而为其后续治疗提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院病理科检验的60例非小细胞肺癌组织蜡块标本作为研究对象，其中男27例，女33例；患者年龄41~78岁，中位年龄55岁；肺腺癌38例，肺鳞癌22例，同时随机取30例癌旁正常肺组织作为对照。

1.2 方法

选择非小细胞肺癌细胞株A549及SK-MES-1，脂质体转染试剂盒，SKA3单克隆抗体，DAB试剂盒，二抗兔SP检测试剂盒（SP-9001）。

在高糖DMEM培养基中添加胎牛血清（10%浓度）后在其中放入非小细胞肺癌细胞株，将培养基放置在有5%CO2以及37℃环境的湿度培养箱内进行细菌株培养，隔天进行1次换液，最后获取对数生长期细胞进行实验操作。

采用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）两步法检测SKA3在非小细胞肺癌及癌旁健康肺部组织中的表达。石蜡包埋组织标本，切片后分别使用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡和水化处理，通过磷酸缓冲盐溶液对切片做常规清洗，添加适量柠檬酸抗原修复液做20 min加热处理后对抗原进行修复，内源性过氧化物酶的去除方法为滴加适量3%过氧化氢-甲醇，再滴加1%山羊血清进行组织封闭处理；滴加适量经过稀释处理的SKA3（1∶800）一抗以及AEG-1（1∶400）一抗，在4℃温度下孵育一晚，第2天滴加适量二抗，在37℃环境中孵育0.5 h后应用DAB显色剂处理，再通过苏木素进行复染，最后在光学显微镜下对细胞进行观察。

以非小细胞肺癌细胞系A549及SK-MES-1为体外研究模型，脂质体转染SKA3 siRNA敲低A549及SK-MES-1中SKA3表达。对经过转染的两组细胞接种至60 mm培养皿内，对细胞变化进行定期观察，并在肉眼可见的克隆已经形成时完成固定染色操作，然后进行拍照和计数，对不同组别克隆形成数目、大小等指标进行对比分析。

Transwell侵袭实验检测敲低SKA3后对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响。脂质体转染SKA3 siRNA敲低非小细胞肺癌细胞株A549及SK-MES-1后24 h后消化，通过无血清培养液进行细胞悬液制备。在transwell小室的上室加入100 µl细胞悬液，在下室添加DMEM完全培养液，培养液内含有10%胎牛血清，培养液添加剂量为600 µl，先在孔板背后均匀地划横线，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。此后进行过夜培养。次日使用枪头和直尺在横线处做垂直划线。应用磷酸缓冲盐溶液进行3次漂洗放置在无血清培养基内，再将其整体放置在培养箱中进行细菌株培养。在开始和第24小时分别在培养皿中获取适量样本，对其样本进行观察并拍摄照片。

脂质体转染SKA3 siRNA敲低非小细胞肺癌细胞株A549及SK-MES-1后转染24 h，替换成无血清培养基，然后通过饥饿处理诱导细胞逐渐凋亡，通过Annexin V-PI完成染色后利用流式细胞检测仪对不同组别细胞凋亡情况进行检测分析。

1.3 观察指标

至少需要2名病理科医师对检查结果进行分析和阅片，以免疫组化染色的具体判读标准确定染色结果或阳性或阴性。

通过平板克隆试验检测敲低SKA3后观察癌细胞克隆能力的变化。对不同组别克隆形成数目、大小等指标进行对比分析。

Transwell侵袭实验过夜培养后细胞次日进行拍照，记录穿膜细胞数量，对细胞侵袭能力做出评价。

通过流式细胞术检测敲低SKA3后的非小细胞肺癌细胞株，分析其表达情况，并评价其对非小细胞肺癌细胞凋亡能力产生的影响。

1.4 统计方法

应用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料经检验符合正态分布，以（）表示，组间比较行t检验；计数资料以[n(%)]表示，组间比较行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SKA3在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达

免疫组化染色显示，SKA3阳性染色呈棕黄色，也可呈褐色，细胞质内较多，细胞核内较少。在非小细胞肺癌组织内SKA3阳性表达率是68.3%(41/60)，高于癌旁正常肺部组织的16.6%(5/30)，差异有统计学意义（χ2=18.678，P<0.05）。见图1。

图1 SKA3在癌旁组织和非小细胞肺癌组织中的表达

2.2 脂质体转染siRNA细胞株敲低SKA3表达后非小细胞肺癌细胞增殖能力变化

平板克隆试验显示，脂质体转染siRNA细胞株敲低SKA3表达后，观察组癌细胞克隆数为（11±2）个，明显少于对照组的（97±11）个，差异有统计学意义（t=-652.977，P<0.05）。见图2。

图2 脂质体转染siRNA敲低SKA3表达后非小细胞肺癌细胞克隆数变化

2.3 脂质体转染siRNA细胞株敲低SKA3表达后非小细胞肺癌细胞凋亡变化

流式细胞仪检测显示，脂质体转染干扰组细胞G1/G0期和S期细胞比率分别为（71.7±6.1）%和（20.2±2.9）%，对照组相应为（53.4±5.4）%和（31.3±4.2）%，两者比较，差异有统计学意义（t=13.922、-14.669，P<0.05）。见图3。

图3 脂质体转染siRNA敲低SKA3表达后非小细胞肺癌细胞凋亡减少

3 讨论

恶性肿瘤组织的侵袭、转移是一项十分复杂的过程，会涉及蛋白水解酶、相关黏附分子、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）或趋化因子等多分子变化的影响。SKA1、2、3均为SKA的靶向复合物，已有研究结果证实，SKA1、2、3可组成SKA复合物，于有丝分裂中期促使纺锤体微管在动粒（kinetochore，KT）上稳定附着，以保证顺利进行有丝分裂。SKA3是位于线粒体外层的子单元SKA复合物，位于13q号染色体上，在正常染色体分离和细胞分裂过程中发挥重要作用[7-9]。已有的临床结果显示，SKA3针对肺癌细胞的增殖和转移期间重要分子进行靶向治疗对提升肺癌临床治疗效果有重要作用。对SKA3基因的表达和肺癌症状体征、预后之间的相关性结果表明，SKA3基因在肺癌病变的产生以及病情进展中均发挥着作用[10-13]。

本研究通过对非小细胞肺癌组织免疫组化结果相关数据做分析后发现，SKA3在非小细胞肺癌中的表达水平相比癌旁正常肺部组织更高（68.3% vs 16.6%）（P<0.05），与林剑鹏等[14]在结肠癌的研究比较类似，该项研究结果显示50例结肠癌组织中高表达33例（66.00%），50例正常组织中高表达6例（12.00%），结肠癌中SKA3表达高于正常组织（P<0.05）。同时增殖能力脂质体转染siRNA敲低SKA3表达后非小细胞肺癌细胞克隆数明显降低，脂质体转染siRNA敲低SKA3表达后非小细胞肺癌细胞凋亡减少，与唐建信等[15]的研究结果有一致性。本研究通过siRNA干扰技术对非小细胞肺癌细胞株内SKA3表达进行抑制，在细胞水平探讨SKA3对肺癌细胞的恶性表型的作用。本研究初次建立对SKA3表达进行干扰的肺癌细胞模型且获得了成功，也开展了细胞克隆实验，结果显示对SKA3干扰表达以后可促使细胞增殖能力下降，本次研究首次创建了干扰SKA3表达的肺癌细胞模型，并且结果显示成功，也通过细胞克隆实验的开展获得了干扰SKA3的表达，在抑制SKA3对肺癌细胞增殖能力产生促进作用中有良好效果的结论，说明SKA3对肺癌细胞增殖能力有促进作用。通过Transwell侵袭实验发现SKA3干扰表达后肺癌细胞侵袭能力明显减弱。通过流式细胞术发现SKA3干扰表达后肺癌细胞凋亡明显减少，说明SKA3可抑制肺癌细胞凋亡。

综上所述，肺癌组织中可有SKA3表达，其在癌细胞增殖、侵袭、克隆形成以及凋亡的恶性表型中有选择性促进作用，分析原因可能和其对细胞周期G1期进入S期的促进能力有一定相关性。干扰SKA3可能是治疗非小细胞肺癌新的治疗选择。此后也会对SKA3在癌细胞增殖中的促进作用和分子机制相关开展进一步研究，以在防治肺癌的工作中发挥作用。