土壤大肠杆菌拮抗菌的分离鉴定

桑茜刘冰艳张雪娇欧阳全喜谌馥佳陈建光

(1.安阳工学院，河南 安阳 455000；2.黄淮学院，河南 驻马店 463000)

世界卫生组织(World Health Organization，WHO)监测报告显示，由于缺乏科学引导，抗生素滥用导致的细菌耐药性增加已成为全球日益严重的公共卫生问题[1，2]。大肠杆菌是一种分布广泛的条件致病菌，极易产生耐药性。抗生素或抗菌药物的大量使用促进了畜禽养殖业的发展，造成大肠杆菌耐药菌株数量不断增加、耐药性不断增强，加剧了大肠杆菌病的防治难度[3]。针对抗生素过度使用，通过益生菌调节肠道菌群的平衡已成为遏制大肠杆菌耐药性增强的一项重要行动计划。

常见的益生菌包括芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等。芽孢杆菌广泛存在自然界中，宋兆齐等[4]通过菌株形态和生理生化的鉴定试验，对整个河南省范围内农田土壤环境中的芽孢杆菌多样性进行了调查，调查结果从分子水平证明，河南省的芽孢杆菌资源非常丰富。芽孢杆菌是一类重要的微生态制剂和益生菌添加剂。田照辉等[5]从池塘边发酵鱼肉汤中分离出6株芽孢杆菌，对其产淀粉酶、产蛋白酶能力及生长情况进行研究，为筛选适合渔用微生态制剂的益生菌提供了新的思路。张同建[6]从健康的鸡仔粪便种分离出9株芽孢杆菌，通过耐酸性试验、耐胆汁试验以及动物饲喂试验，为研究芽孢杆菌菌株及开发成益生菌制剂提供一定的理论指导。张荣岭[7]认为，芽孢杆菌具有拮抗病原菌、调节肠道菌群、提升机体免疫力、改善生产性能等作用。尹杨燕等[8]研究表明，枯草芽孢杆菌GX20200511-1对沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌效果，可以显著降低共培养24h后的指示菌数量。崔亚微[9]研究证明，从土壤中分离鉴定的贝莱斯芽孢杆菌具有良好的耐酸、耐胆盐及抗大肠杆菌作用，为其在动物养殖和饲料防霉中的应用提供坚实的理论依据。

目前国内外报道中，益生菌主要分离自动物肠道和非肠道(如植物和相关作物食品等)[10]，而分离自土壤中的芽孢杆菌则多应用于农业生物防治领域。崔晓等[11]报道利用芽孢杆菌开发的生防菌剂和生物制剂被广泛应用。邱月[12]研究表明，枯草芽孢杆菌可以有效促进植物病虫害的防治、促进植物营养吸收、提升作物产量品质和改良土壤品质。为了研究分离自土壤中的芽孢杆菌对大肠杆菌的抑制效果，本试验从河南省驻马店市试验林中采用五点采样法收集土壤样品，通过菌株分离纯化、大肠杆菌抑菌试验、16S rDNA序列分析鉴定和系统发育树构建获得具有抑菌效果显著的2株枯草芽孢杆菌FX5和FX6，为研究土壤芽孢杆菌作为益生菌防治大肠杆菌的潜质提供一定的理论依据。

1 材料

1.1 试验材料

土壤样品来源于河南省驻马店市黄淮学院试验林。大肠杆菌(Escherichia coli)由安阳工学院生物与食品工程学院生物技术实验室提供。

1.2 主要仪器

高温高压蒸汽灭菌锅(LDZLDZM-40KCKCS)，购于上海中安医疗器械厂；超净工作台(SW-CJ-2D型)，购于上海树立仪器仪表有限公司；恒温培养箱(SHP型)，购于北京中兴伟业仪器有限公司；恒温震荡培养箱，购于江苏科析仪器有限公司；离心机(Centrifuge 5230R)，购于德国艾本德公司。

2 方法

2.1 样品的采集

采用五点取样法从试验林采集点采集5～10cm深的土壤。准备无菌纸袋，无菌纸袋中放入采集得到的土壤样品，标记采集地点、时间、植被类型，将其放于阴凉通风处阴干，经研钵研碎备用。

2.2 菌株的分离和纯化

采用李静泉等[13]试验方法，通过稀释平板涂布法从土壤样品中分离纯化菌种。制备土壤悬浮液，向150mL无菌三角瓶中加入90mL灭菌生理盐水，称取10g土壤样品加入三角瓶中，制成土壤悬浮液；制备浓度梯度悬浮液，用移液器吸取1mL土壤悬浮液于无菌试管中，加入9mL无菌水，混匀后从中吸取1mL加入第2个无菌试管中并加入9mL无菌水，以此类推制成10-3、10-4、10-53个浓度梯度的土壤菌悬浮液，每个浓度梯度重复3次；分离纯化菌株，分别吸取不同稀释度的土壤悬浮液200μL均匀涂布于LB(Luria-Bertani)培养基、高氏一号培养基上，重复3次，置于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，挑选菌落进行多次划线纯化得到纯种菌株，将纯种菌株转入LB斜面培养基4℃保存。

2.3 牛津杯法抑制大肠杆菌试验

挑取纯化后的菌种，进行液体摇瓶培养，利用旋转蒸发仪对菌液进行蒸馏，获得纯度较高的单菌落菌悬液。根据张同建[6]试验方法将10mL大肠杆菌菌悬液与45℃的LB培养基在无菌培养皿中混匀；用灭菌后的打孔器在冷却后的培养基上进行打孔(孔的直径为0.6cm)；取100μL分离获得的单菌落菌悬液置于每个孔中；将含有单菌落菌悬液的培养基放入恒温培养箱中36.5℃恒温培养12h，观察记录抑菌圈的大小。

2.4 16S rDNA序列分析鉴定

参考SK8255(细菌)Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)对大肠杆菌拮抗菌株进行细菌基因组DNA的提取。参考李肖鹤等[14]方法，利用细菌16S rDNA通用引物Primer A(5＇-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇)和Primer B(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)为上下游引物对菌株的16 SrDNA进行基因扩增；PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测后，切胶回收，送至上海生工生物工程有限公司进行测序；获得序列后上传到GenBank中进行BLAST 序列分析比对；运用MEGA软件构建系统发育树[15]；参考菌株的菌落形态，综合确定该菌株的亲缘关系和种属地位。

3 结果分析

3.1 菌株的分离和纯化

经过初筛、复筛，在分离培养基上分离得到7株遗传性状稳定的土壤菌株，将其编号为FX1～7，各菌株的菌落形态特征见表1。

表1 菌落形态特征

3.2 牛津杯法抑制大肠杆菌试验结果

参考张同建[6]方法对初步筛选得到的7株菌株进行大肠杆菌的抑菌性试验，抑菌结果分析表明：依据抑菌圈直径大小比照与分析，FX7菌株对大肠杆菌无抑制作用，另外6株目的菌株对大肠杆菌抑菌效果依次为FX5>FX6>FX3>FX2>FX1>FX4。FX1菌株和FX4菌株抑菌圈直径分别为1.8mm和0.8mm，抑菌效果较弱；FX2菌株和FX3菌株抑菌圈直径分别为10.2mm和11.6mm，抑菌效果一般；FX5菌株和FX6菌株抑菌圈直径分别为20.9mm和18.1mm，菌株抑菌效果明显，拮抗作用显著。其中FX5菌株的抑菌圈直径最大，抑菌能力最显著，为后续挑选具有优良抑制大肠杆菌效果的微生物制剂提供一定的依据。

3.3 菌株的分子生物学鉴定结果

从图1可以看出，菌株FX1～6提取的DNA碱基对在1200～2000bp。

图1 FX1～6的DNA凝胶电泳分析

将对大肠杆菌具有拮抗效果的6株菌株的16S rDNA基因测序交由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果与NBCI数据库进行BLAST比对分析，并使用MEGA软件绘制系统发育树，见图2，鉴定结果显示FX1菌株与Amycolatopsis japonica strain MG 417-CF 17亲缘性强，归为拟无枝菌属；FX3菌株与Streptomyces sp.strain 2H-HV12亲缘性强，归为链霉菌属；FX4菌株与Bacillus paramycoides strain Mu3 AM亲缘性强，归为芽孢杆菌属。FX2、FX5和FX6菌株与Bacillus sp.(in：Bacteria)strain亲缘关系最近，结合其菌落培养特征初步确定菌株FX2、FX5和FX6归为枯草芽孢杆菌，针对抑制大肠杆菌效果最优的拮抗菌株FX5和FX6后续应补充菌株的生理生化特性等试验进行下一步研究。

图2 FX1～6菌株的系统发育树

4 讨论与分析

芽孢杆菌数量庞大、种类繁多，广泛应用于饲料加工、医药业、农业、工业等诸多行业，具有极强的适应能力、广谱的生防潜力[16]和多方面的益生性能[17]。Bacon等[18]研究发现，玉米内生芽孢杆菌和玉米病原菌(串珠镰孢菌)竞争玉米相同的生态位点可以降低病原菌的致病性。蒋广志等[19]、赵荣等[20]等研究表明，在动物饲料中添加芽孢杆菌益生菌活菌制剂，使益生菌成为动物肠道内的优势菌群，能够有效控制和预防动物疾病。荣艳君等[21]等发现，解淀粉芽孢杆菌R3分泌的surfactin类抗菌脂肽通过改变细胞膜通透性能够破坏细胞膜、裂解细胞，抑制产生多重耐药性的大肠杆菌。本研究从自然土壤中筛选出6株大肠杆菌拮抗菌株，根据菌株生物学形态观察与分子生物学鉴定分析，最终得到对大肠杆菌拮抗效果显著的FX5和FX6菌株，与崔亚微[9]、杨炽光[16]研究结果一致，说明分离自自然土壤中的芽孢杆菌对大肠杆菌具有较好的抑制作用，为土壤益生菌的开发利用提供一些理论依据。

张荣岭[7]报道枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是重要的工业菌株，也是饲料添加剂品种目录中可直接饲喂动物的微生物添加剂菌种；目前以枯草芽孢杆菌及细菌素为主要成分的微生态制剂作为饲用抗生素替代品被广泛使用。本试验对大肠杆菌拮抗菌株进行BLAST比对分析和系统发育树构建，结合其菌落培养特征，初步认为拮抗效果显著的FX5和FX6菌株归为枯草芽孢杆菌，后续应补充其生理生化特性的试验和对其他有害细菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌拮抗效果的研究。本试验为不断丰富和开发利用具有优良大肠杆菌拮抗效果的土壤微生物资源提供了一定的理论依据和技术支持，可以考虑将FX5和FX6菌株尝试运用于动物饲料添加剂中[22]，对其益生特性和益生作用机理做深入研究，为其合理应用提供理论依据。