基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨益肾疏肝汤对卵巢储备功能减退大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴及卵巢颗粒细胞凋亡的影响

肖 潇,刘艳霞,危一飞,邢 玉,刘 君,滕秀香

(1.首都医科大学附属北京中医医院,北京 100010;2. 北京中医药大学东方医院,北京 100078;3. 中国中医科学院望京医院,北京 100102)

卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)是指卵巢中卵母细胞的数目减少或质量下降,引起女性生殖功能减退,同时伴有抗苗勒管激素(AMH)水平降低、窦卵泡数(AFC)减少、基础促卵泡生成素(FSH)水平升高[1]。该病发生率为10%～35%[2],是妇科常见病、疑难病,临床常表现为生育能力减低、月经紊乱、性激素缺乏或波动相关症状[3],严重影响了女性的生殖和身心健康。目前DOR的发病机制尚不完全明确,普遍认为多种因素引起的卵巢颗粒细胞过度凋亡、卵泡闭锁加速、卵母细胞数量及质量下降是DOR的重要发病机制,其中磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路与卵巢颗粒细胞凋亡密切相关。国内外对于DOR尚无统一的、确实有效的治疗方法,临床常采用性激素治疗模拟女性正常生理周期,提高患者的生活质量,改善其临床症状,但禁忌证及慎用情况较多,对患者卵巢储备及生育力改善效果不明显[4];对有生育需求的患者,建议积极试孕或辅助生殖技术(ART)[5-6]。中医药治疗DOR具有优势,可以多系统、多靶点调控性腺轴,缓解临床症状,保护卵巢功能[7-8]。滕秀香教授传承柴嵩岩国医大师学术思想,结合多年临床经验,提出肾虚肝郁证为DOR的主要病机,以补肾疏肝为法治疗[9]。前期研究发现益肾疏肝汤治疗肾虚肝郁型DOR可明显改善患者临床症状和卵巢储备功能,调节性激素水平[10]。本实验基于PI3K/Akt/mTOR信号通路,观察了益肾疏肝汤对DOR大鼠丘脑-垂体-卵巢轴及卵巢颗粒细胞凋亡的影响,探讨其治疗DOR的分子机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康SD雌性大鼠32只,12周龄,体重(180±20)g。购于中国食品药品检定研究院,动物许可证号:SCXK(京)2017-005。大鼠饲养于中国中医科学院实验动物中心,自由饮水、摄食,适应性喂养7 d,记录动情周期。本实验已由首都大学附属北京中医医院动物伦理委员会审查批准(2022-05-08),所有操作符合《实验动物管理条件》要求。

1.2药物及制备 益肾疏肝汤(女贞子15 g、熟地黄10 g、旱莲草15 g、北沙参20 g、石斛10 g、续断15 g、桑寄生15 g、菟丝子15 g、酒白芍10 g、月季花6 g、柴胡5 g、白梅花10 g、丹参10 g、桃仁10 g、瞿麦6 g、葛根6 g、甘草6 g)组方各味药材购自首都医科大学附属北京中医医院,按照常规方法水煎、浓缩。临床使用成人(60 kg)每日用量3.07 g生药/kg;根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算,益肾疏肝汤高、中剂量分别相当于临床等效剂量的2倍、1倍,配制浓度分别为3.83 g/mL、1.92 g/mL。雷公藤多苷片购自上海复旦复华药业有限公司(国药准字Z31020415,生产批号:210102,规格:10 mg/片),造模剂量为50 mg/(kg·d),配置浓度为5 mg/mL。

1.3主要试剂与仪器 FSH检测试剂盒(货号:南京建成H101-1-1)、促黄体生成素(LH)检测试剂盒(货号:南京建成H206-1-1)购自南京建成生物工程研究所,雌二醇(E2)检测试剂盒(货号:CEA461Ge)、AMH 检测试剂盒(货号:CEA228Ra)、促性腺激素释放激素(GnRH)检测试剂盒(货号:CEA843Ra)购自武汉云克隆科技股份有限公司;苏木素伊红(HE)染色试剂盒(货号:G1120)购自北京索莱宝科技有限公司;mTOR抗体(货号:ab32028)、PI3K抗体(货号:ab40776)均购自英国Abcam公司,Akt抗体(货号:9272s)购自美国CST公司,内参GAPDH抗体(货号:AB-P-R 001)购自杭州贤至生物科技有限公司。Western blot电泳系统(美国Bio-rad公司),高速冷冻离心机(型号:FRESCO 21,美国 Thermo fisher公司),水平脱色摇床(型号:WD-9405C,北京六一仪器),酶标仪(美国Bio-rad公司),二氧化碳培养箱(美国Thermo公司),超纯水仪(MILi-Qso型,美国Millipore公司),显微镜(德国Zeiss公司),共聚焦显微镜(型号:LSM 780,德国Zeiss),台式玻片扫描机(型号:Aperio CS2,德国Leica)。

1.4实验方法 32只大鼠动情周期均正常,随机选取8只作为空白组(不予特殊处理),其余大鼠给予雷公藤多苷片混悬液50 mg/(kg·d)连续灌胃14 d建立DOR模型。造模后观察大鼠阴道涂片,发现出现某一期时间延长、周期紊乱表现证明造模成功。将24只造模成功大鼠随机分为模型组、益肾疏肝中剂量组、益肾疏肝高剂量组,每组8只。于造模后第16天开始,空白组和模型组给予生理盐水3 mL/次灌胃,益肾疏肝高、中剂量组分别给予益肾疏肝汤生药32.76 g/kg、16.38 g/kg灌胃,均每日1次,连续灌胃15 d。

1.5取材 末次灌胃结束后,采用0.3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采集血液样本2 mL;处死动物,于无菌条件下取出全子宫、卵巢称重,一侧卵巢浸泡于10%中性福尔马林溶液中待测,另一侧卵巢存放于-80 ℃冰箱备用。

1.6观察指标及方法

1.6.1动情周期紊乱率 细棉签蘸取生理盐水,在大鼠阴道内轻轻地旋转2圈,行阴道涂片。待涂片风干后30 min,将涂片置于苏木素染料中浸泡3 min,在流水下轻轻冲洗5 s,然后浸泡于1%盐酸酒精溶液中分化10 s,在流水下轻轻冲洗5 s后,放入伊红染料中浸泡1 min,水洗5 s。显微镜下记录、观察阴道脱落细胞的种类和形态,判断大鼠动情周期,计算动情周期紊乱率。

1.6.2血清性激素水平 将血液标本静置,离心取血清,使用ELISA法,严格按照试剂盒说明书检测血清GnRH、FSH、LH、E2、AMH水平。

1.6.3卵巢形态学 取用10%中性福尔马林固定24 h的卵巢,石蜡包埋,制成5 μm的切片。HE染色后,显微镜观察卵巢形态、各级卵泡数,采用ImageScope软件记录。

1.6.4卵巢颗粒细胞内Bcl-2、Bax表达情况 采用免疫组织化学方法检测卵巢颗粒细胞内Bcl-2、Bax蛋白表达情况。根据卵泡内颗粒细胞免疫组化染色的深浅分为4级,为了便于统计处理,予以半定量计分:未被染色为阴性表达(-)计1分,深棕色为弱阳性表达(+)计2分,棕黄色为中度阳性表达()计3分,棕褐色为强阳性表达()计4分,每张切片观察5个视野。

1.6.5卵巢组织中PI3K、Akt、mTOR表达情况 采用Western blot法检测:提取卵巢组织蛋白,加入RIPA buffer细胞裂解液,按照BCA法测定卵巢组织蛋白浓度,蛋白浓度调整为2 μg/μL。将样品进行凝胶电泳、转膜、封闭,加入一抗孵育(稀释比例为1∶1 000),4 ℃水平摇床孵育过夜。TBST洗涤膜3×10 min,5%脱脂奶粉封闭液稀释二抗,室温孵育60 min。再次用TBST洗涤膜3×10 min后,化学发光、曝光拍照。以GAPDH为内参,应用Image J软件对各条带进行灰度值分析。

2 结 果

实验过程中,各组大鼠均无死亡。空白组大鼠一直状态良好,被毛光滑,饮食、饮水正常;模型组大鼠精神状态差,被毛稀松,饮食、饮水量减少;与模型组相比,益肾疏肝中、高剂量组大鼠上述表现均有所改善,大鼠精神状态转佳,被毛逐渐光滑,饮食及饮水量增加。

2.1动情周期紊乱率 造模结束后,各造模大鼠的动情周期紊乱、延长,动情次数明显减少,动情周期紊乱率明显高于空白组(P<0.05)。灌胃结束后,模型组大鼠的动情周期仍紊乱及延长;益肾疏肝中、高剂量组大鼠的动情周期有一定程度地恢复,动情次数增加,动情周期紊乱率明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和卵巢储备功能减退各组大鼠动情周期比较

2.2血清性激素水平 与空白组比较,模型组大鼠血清GnRH、FSH、LH水平均明显升高(P均<0.05),血清E2、AMH水平均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,益肾疏肝中、高剂量组血清GnRH、FSH、LH水平均明显降低(P均<0.05),血清E2、AMH水平均明显升高(P均<0.05);益肾疏肝高剂量组血清GnRH水平明显低于益肾疏肝中剂量组(P<0.05),血清E2、AMH水平明显高于益肾疏肝中剂量组(P均<0.05),2组间血清FSH、LH水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和卵巢储备功能减退各组大鼠血清性激素水平比较

2.3卵巢组织形态 空白组大鼠卵巢结构清晰,各级卵泡均发育良好,成熟卵泡中颗粒细胞层次多、卵泡液多,可见完整的卵母细胞,卵巢间质中未见明显炎细胞浸润及纤维化;模型组大鼠卵巢结构明显紊乱,各级生长卵泡数目均明显减少,闭锁卵泡数目显著增多,未见成熟卵泡,卵泡中颗粒细胞层数减少,排列紊乱而疏松,卵巢间质可见大量炎细胞浸润及纤维化;益肾疏肝中剂量组大鼠卵巢组织病理形态较模型组有所改善,各级生长卵泡及成熟卵泡数量有所增加,卵泡液含量增多,仍可见一些闭锁卵泡,卵巢间质可见少量炎细胞浸润及纤维化;益肾疏肝高剂量组大鼠卵巢组织病理形态明显改善,仅见少量闭锁卵泡,各级卵泡数均增加,成熟卵泡数量明显增加,颗粒细胞层次增多,卵泡液含量增多。见图1。

图1 空白组和卵巢储备功能减退各组大鼠卵巢组织形态(HE,×100)

2.4卵巢颗粒细胞内Bcl-2、Bax蛋白阳性表达情况 与空白组比较,模型组大鼠卵巢粒细胞内Bcl-2蛋白阳性表达明显减少,阳性表达评分明显降低(P<0.05);Bax蛋白阳性表达明显增加,阳性表达评分明显升高(P<0.05)。与模型组比较,益肾疏肝高、中剂量组卵巢颗粒细胞内Bcl-2蛋白阳性表达明显增加,阳性表达评分明显升高(P均<0.05);Bax蛋白阳性表达明显减少,阳性表达评分明显降低(P均<0.05)。益肾疏肝中剂量组与益肾疏肝高剂量组Bcl-2、Bax蛋白阳性表达评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2及表3。

图2 空白组和卵巢储备功能减退各组大鼠卵巢颗粒细胞内Bcl-2、Bax蛋白阳性表达情况(免疫组化染色)

表3 空白组和卵巢储备功能减退各组大鼠卵巢颗粒细胞内Bcl-2、Bax蛋白阳性表达评分比较分)

2.5卵巢组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达情况

模型组大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量均明显低于空白组(P均<0.05);益肾疏肝中、高剂量组卵巢组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05),益肾疏肝中剂量组与益肾疏肝高剂量组PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3及表4。

图3 空白组和卵巢储备功能减退各组大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达情况

表4 空白组和卵巢储备功能减退各组大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量比较

3 讨 论

DOR是卵巢功能衰竭的前期,临床上肾虚肝郁证为其常见证型,补肾填冲、疏肝养血为常用治法。补肾疏肝类中药对比激素类药物治疗DOR的一项Meta研究显示,补肾疏肝法改善激素水平、提高AMH及窦卵泡数的效果与西药相当,但不良反应较小[11]。滕秀香教授传承柴嵩岩国医大师学术思想,结合自身临床经验,总结而成的益肾疏肝汤为北京中医医院治疗DOR的科内协定处方,该方补肾疏肝的同时养血柔肝、退热生津以护阴液,滋阴而不壅滞,疏肝而不辛燥。相关研究显示该方中续断、女贞子、熟地黄等单药具有双向调控血清性激素水平,刺激卵泡生长,增加子宫腺体数,保护卵巢功能的作用[12-15]。张慧等[16]和倪瑞珺等[17]研究证实补肾疏肝类复方可调控PI3K/Akt信号通路、调节Bcl-2/Bax表达水平,减少卵巢颗粒细胞凋亡,提高卵巢储备功能。颗粒细胞凋亡过度会加速卵巢卵泡闭锁,引起DOR[18-19]。鉴于此,笔者推测益肾疏肝汤的治疗作用可能是:调节PI3K/Akt信号通路→调控凋亡因子的表达→抑制卵巢颗粒细胞凋亡→减少卵泡闭锁→提高卵巢储备功能→治疗DOR。

血清性激素水平是直接反映卵巢功能的重要指标,其中FSH水平、FSH/LH比值升高及AMH水平下降为临床诊断DOR的主要指标,E2水平为诊断DOR的重要参考。本实验采用经典的雷公藤多苷灌胃诱导DOR ,结果显示造模后的大鼠血清GnRH、FSH、LH、E2、AMH水平及卵巢病理形态变化均符合DOR的诊断要点,证实此造模方法可行。DOR大鼠经益肾疏肝汤干预后,其精神状态转佳,被毛逐渐光滑,饮食及饮水量增加,动情周期趋于正常;血清GnRH、FSH水平明显降低,血清E2、AMH水平明显升高,且益肾疏肝汤高剂量组改善更明显;HE染色显示卵巢结构有恢复,各级生长卵泡及成熟卵泡数量增加,闭锁卵泡、炎细胞浸润减少,益肾疏肝汤高剂量组改善更明显,但仍未能恢复至造模前状态。提示益肾疏肝汤对DOR大鼠下丘脑-垂体-性腺轴具有一定的调控作用,可改善卵巢储备功能。

目前多数医者赞同卵巢颗粒细胞过度凋亡是引起卵巢功能提前下降的主要原因。Bcl-2蛋白家族介导的线粒体内源凋亡通路在卵巢颗粒细胞凋亡过程中占有主导地位[20]。其中抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的比值被称为细胞的“凋亡开关”[21],影响卵泡发育或闭锁。当Bcl-2/Bax下降时,可诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡;而纠正相关凋亡蛋白表达,可减缓颗粒细胞凋亡,从而一定程度恢复卵巢功能[22-23]。有研究表明PI3K/Akt信号通路在卵巢颗粒细胞的分化中扮演着重要角色,当小鼠卵巢颗粒细胞的Akt1基因被敲除后,颗粒细胞的存活率明显降低,且小鼠卵巢中的卵泡数量明显减少[24]。颗粒细胞中的PI3K通路被激活后,PI3K、Akt磷酸化水平增加,进一步激活下游基因mTOR,通过活化Bcl-2关联死亡启动子(BAD)调控Bcl-2/Bax表达而抑制人卵巢颗粒细胞凋亡,促进卵泡的成熟和排卵[25-26]。本实验结果显示,模型组大鼠Bcl-2蛋白阳性表达明显减少,Bax蛋白阳性表达明显增加,PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量明显降低,说明雷公藤多苷可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡,与HE染色结果一致;益肾疏肝汤干预后,Bcl-2蛋白阳性表达明显增加,Bax蛋白阳性表达明显减少,PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量明显升高,提示益肾疏肝汤可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,上调Bcl-2表达和下调Bax表达而抑制卵巢颗粒细胞凋亡,发挥保护卵巢的作用。

综上所述,益肾疏肝汤可能通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白,上调Bcl-2表达和下调Bax表达,以抑制DOR大鼠的卵巢颗粒细胞凋亡,改善卵巢病理变化。但本研究由于经费限制,未使用Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达量,未使用 RT-PCR 法检测PI3K、Akt、mTOR mRNA表达量,研究结论有待进一步验证;且与DOR相关信号通路(NF-κB、MAPK、Wnt等)及基因(BMP15、p53、Klothos等)较多,益肾疏肝汤是否可通过其他途径发挥作用还有待研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。