清热化瘀方调节凋亡与自噬减轻大鼠急性脑缺血损伤的作用研究*

宋春林 龚 方 刘伍才 袁金华 曾宪晶

缺血性脑血管病(Ischemic cerebrovascular disease,ICD)是一类因脑局部血液循环中断引起的神经功能障碍性疾病,临床多见于中老年人。随着中国人口老龄化加快,脑血管疾病目前己经成为中国致死、致残的主要疾病之一,其中缺血性脑卒中最为突出,约占脑血管疾病的70%[1]。ICD具有高发病率、高病死率、高致残率的特点,ICD目前尚缺乏有效的防治手段,给患病家庭带来沉重的医疗负担。

中医防治中风积累了丰富的经验,“毒损脑络”是中医脑病学认识、研究、诊疗中风病的重要病理机制,清热化瘀方是根据王永炎院士和国医大师任继学关于“毒损脑络”理论遣药组方而成,具有“祛瘀清热、涤痰解毒”之功效,切中了中风的病机和治疗要点[2]。随着中医药现代化研究进展,中药所具有的多层次、多靶点、多途径的优势得到进一步挖掘,研究发现:大多数活血化瘀类中药可通过调控自噬及凋亡途径来发挥脑保护作用,调节自噬与凋亡是脑缺血损伤有潜力的治疗策略[2,3]。本实验通过观察清热化瘀方对急性脑缺血损伤大鼠神经元自噬与凋亡的影响,探究其对脑损伤的部分保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料选用50只体质量为250±50 g 的SPF级SD大鼠,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,实验单位使用许可证编号为:SYXK 2012-0001,行适应性喂养1周后转入实验造模。药物从院内中草药房购入,清热化瘀方药物组成(水牛角30 g,水蛭12 g,赤芍15 g,丹参15 g,地龙10 g,川芎12 g,牛膝10 g,天竺黄10 g,酒大黄6 g,胆南星6 g)。煎制:将中药加水至500 ml,煎至药液剩下约150 ml时倒出保存,接着将煎过的中药再次加水300 m1,煎得药汁50 m1,最后将2次煎煮所得的药汁混合,保鲜备用。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药采用随机数字表法将大鼠分为5组:假手术组、缺血模型组、清热化瘀方低中高剂量组,每组10只,采用《缺血性脑损伤模型的研究》[4]操作方法对大鼠进行大脑中动脉梗阻模型造模(MCAO),其中假手术组术中插入约8 mm鱼线,不足以阻断大脑中动脉血流。清热化瘀方各剂量组在术后2 h灌胃等体积的清热化瘀方汤液,给药剂量参照人与动物体表面积折算的等效剂量系数折算法[5],清热化瘀方各低、中、高剂量组分别予清热化瘀方汤液按(0.7、1.4、2.8 m1/100 g) 灌服。假手术组和模型组均予等体积生理盐水灌胃,各组每天定时2次灌胃,连续2周后处死取样。

1.2.2 神经功能评分标准大鼠造模清醒后,采用Longa的5 级神经功能缺损评分法[6]对大鼠进行神经功能缺损评分,筛选评分为1～3 分者纳入试验研究。

1.2.3 切片制作与染色将大鼠深麻后仰卧位固定,完整取出的脑组织,4%PFA于4 ℃固定脑组织48 h,在移入30%蔗糖溶液中至脑组织沉入底部,使用冰冻切片机将脑组织切成20 μm切片,然后吸附到防脱载玻片上,-20 ℃储存。常规 HE染色后,在10×20倍镜下观察大鼠神经细胞病理形态变化。

1.2.4 TUNEL细胞凋亡检测将制作完成的石蜡切片脱苯后依次浸泡于不同浓度的无水乙醇,蛋白酶K中孵育后清洗切片,加入TUNEL反应混合物,用PBS溶液封片,置于荧光显微镜下进行观察,凋亡细胞在450～500 nm波长下激发绿色荧光,计算出凋亡细胞比例。

1.2.5 Western-blot检测脑组织自噬与凋亡蛋白完整取出大鼠脑组织标本匀浆处理后提取样本总蛋白,接着进行蛋白含量的测定,SDS-PAGE电泳,转膜,免疫反应,化学发光,显影定影成相,利用凝胶图像处理系统分析计算目标条带灰度值。

2 结果

2.1 各组神经功能缺损评分假手术组神经功能评分为0分,说明假手术组未出现神经功能损伤;与假手术组相比,缺血模型组和清热化瘀方组均出现明显的神经功能损伤(P<0.01);与模型组比较,清热化瘀方组神经功能评分明显下降(P<0.05),其中高剂量组降低明显。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 (分,

2.2 大鼠HE染色情况假手术组大鼠神经元形态完整,胞膜呈圆或椭圆形,核仁大小不一,胞核染色清晰。缺血模型组神经元排列紊乱,细胞间隙增宽、胞体皱缩,核固缩,胞核异形且染色质深染,核仁消失。清热化瘀方各组见有少量神经元胞核异形,染色质深染,细胞间隙缩短,整体病理损伤改变较缺血模型组减轻,以清热化瘀方-高剂量组改善更明显。见图1。

图1 大鼠HE染色图

2.3 各组大鼠神经细胞凋亡情况假手术组少量被染色的TUNEL阳性细胞,缺血模型组和清热化瘀方组TUNEL阳性细胞明显高于假手术组(P<0.01);与缺血模型组比较,清热化瘀方各剂量组TUNEL阳性细胞比例下降(P<0.05)。见表2,图2。

表2 各组大鼠神经功能凋亡比例比较 (只,

2.4 大鼠脑组织自噬和凋亡蛋白水平结果结果显示:各组脑组织中均见Beclin-1、LC3、Caspase-3蛋白的表达;与缺血模型组比较,清热化瘀方各剂量Beclin-1和LC3蛋白表达量上升,Caspase-3蛋白表达水平下降(P<0.05)。见表3,图2。

注:A假手术组,B缺血模型组,C清热化瘀方-低, D清热化瘀方-中,E清热化瘀方-高图2 各组自噬和凋亡在蛋白水平的变化

表3 各组大鼠自噬和凋亡蛋白水平结果 (只,

3 讨论

近年来,多项研究报道凋亡和自噬在缺血性脑卒发生发展中的重要作用,凋亡是脑缺血后神经元死亡的主要形式之一[7]。细胞凋亡是在特定基因调控下进行的一种主动性死亡过程,是维持细胞内环境稳定的重要机制之一。自噬是一种可逆的细胞死亡形式,可以使细胞重生,其与坏死和凋亡使细胞最终走向死亡的命运不同,自噬对胞内各类物质持续更新及进化起保护作用。生理条件下的基础自噬对维持细胞基因组的稳定性、促进损伤细胞衰老、对细胞内大分子物质的循环利用中发挥着重要作用。然而,当不足或者过度的自噬过程在细胞内发生时,则会导致细胞内环境失衡,最终会引导细胞走向死亡[8]。因此,从调节凋亡和自噬切入,或许能成为缺血性脑卒中治疗中有潜力的策略。

Caspase依赖性凋亡是凋亡的2种主要机制之一,Caspase的表达变化与细胞凋亡密切相关[9],在Caspase家族蛋白中,Caspase-3是参与凋亡过程的最终效应因子。Beclin-1、LC3是参与自噬过程的主要蛋白,其中Berlin-1作为自噬的直接执行者,不仅可促进自噬吞噬体的形成,增加自噬的发生,还参与神经细胞凋亡[10]。而以LC3复合物为代表的蛋白分子则参与了自噬体膜的形成,进一步参与自噬的降解阶段[11]。Beclin-1、LC3作为反映细胞自噬发生及强度的代表性指标,在缺血性脑卒中的进展过程中具有重要的指示作用。有研究显示,在急性脑梗死大鼠模型中,LC3和Beclin 1上调参与诱导了自噬,予自噬抑制剂(3-MA)后可抑制自噬的激活,减轻了脑缺血损伤。本研究显示:各组大鼠脑组织中均见Beclin-1、LC3、Caspase-3蛋白的正常少量表达[12],与缺血模型组比较,清热化瘀方各剂量组Beclin-1和LC3蛋白表达量上升,Caspase-3蛋白表达水平下降,TUNEL染色阳性细胞降低,HE染色病理损伤减轻,表明清热化瘀方可能通过调节凋亡和自噬蛋白水平而起到脑保护作用。

缺血性中风病因、病机复杂,王永炎院士提出“毒损脑络”理论,指出毒损脑络为病机关键[13],发病总由瘀毒、热毒、痰毒、火毒痹阻,脑髓神机受损而致,“脑络瘀阻”既成,“痰瘀饮”蕴结化热而毒变,其中“痰瘀热结”为重要环节,而“痰瘀→蕴热→毒变→髓伤”是缺血性中风重要病理连锁反应,与临床医学实践提出的脑内兴奋性毒性物质、氧自由基、炎性免疫因子等异常即为“毒邪”一致。痰瘀久之而积热,热结则毒生,这些病理因素相互影响,又形成新的致病因素的恶性循环,最终加重病情。在“毒损脑络”病机理论指导下进行组方的清热化瘀方是根据缺血性中风的病机演变特点遣药组方而成,全方以水牛角清热化瘀、解毒;丹参活血通络、 清心, 同为君药;赤芍、川芎、水蛭加强丹参活血通络之效, 地龙、酒大黄既可活血, 又可清热解毒, 共为臣药;佐以胆南星化痰开窍, 天竺黄清热化痰, 牛膝引血热下行,诸药合用,共奏清热解毒、化瘀通络之功。清热化瘀方通过打断“血瘀、痰饮、热毒、再瘀塞”的恶性病理循环而减轻患者症状,在前期研究发现其对缺血性中风的具有较好的疗效[14,15]。

综上,清热化瘀方可能通过调节凋亡和自噬从而起到减轻脑缺血损伤的作用,为“毒损脑络”理论防治缺血性中风提供了较好的实验依据。