工业大麻种子萌发及渗透胁迫下实时荧光定量PCR 内参基因的筛选

张涵雪，张 达，胡建明，汤开磊，杜光辉

(云南大学 资源植物研究院，云南 昆明 650500)

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）是一种高效的、可用于检测基因在植物体内表达量的生物技术，具有灵敏、快速、特异性强的特点[1].理想的内参基因在不同植物体的各细胞、组织、器官以及生长发育的各个阶段表达都是稳定的，但试验证明qRT-PCR 的结果受到许多因素的影响，如RNA 的浓度、RNA 的质量、反转录和PCR 反应的效率以及参考基因的选择等[1-2].许多研究结果表明不同样品、组织、处理条件等都会影响基因的表达[3-6]，因此，为了使qRT-PCR 分析结果更准确可靠，在对基因表达量进行分析时，需要根据具体的试验条件，筛选适宜的内参基因对数据进行校正和标准化，以减少实验误差.

大麻(Cannabis sativaL.)是一年生草本植物，隶属大麻科(Cannabaceae)大麻属(Cannabis)，又称火麻、汉麻等.工业大麻是指植株群体花期顶部叶片及花穗干物质中四氢大麻酚(THC)质量分数低于0.3%的大麻品种类型[7].工业大麻具有多方面的利用价值，包括传统的纤维和种子的加工利用[8-9]，对重金属污染土壤的修复[10-13]，以及对含有的许多酚类、萜类和黄酮类等药用成分的开发[14-16].为了不与粮食争地，工业大麻一般种植在盐碱地、山坡地、冬闲地等非主要良地，易受到盐碱、干旱、低温等非生物胁迫的影响.干旱、盐碱等因素会使植物细胞水分亏缺造成渗透胁迫，对植物的生长发育尤其是种子萌发产生不利影响[17-18].为了解决以上非生物胁迫对工业大麻种植造成的限制，本课题组一直致力于渗透胁迫下工业大麻种子萌发的机制研究，发掘工业大麻中抗逆相关的基因.以上工作的前提，需要对相关基因进行表达分析，而稳定可靠的内参基因的选择是前期条件.前人对大麻内参基因的筛选研究，主要集中在纤维用大麻茎中木质素的生物合成内参基因的筛选[19]，野生和栽培大麻不同发育阶段和不同器官中的内参基因的表达稳定性的确定[20].对于工业大麻种子萌发及渗透胁迫下内参基因筛选的研究还存在空白，因此，开展工业大麻种子萌发与渗透胁迫下的内参基因筛选研究，对后期相关的基础研究具有重要意义.

本研究以‘云麻7 号’为试验材料，通过设置正常萌发处理和渗透胁迫下萌发处理，利用qRT-PCR技术，检测候选内参基因在不同样品中的表达量，筛选出在本研究中表达最稳定的内参基因.研究结果将为后续开展工业大麻种子萌发及其响应渗透胁迫相关的分子机制研究提供前期基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料试验所用的‘云麻7 号’种子由云南省农业科学院经济作物研究所提供.挑选颗粒饱满、大小一致的种子，70%酒精进行表面消毒，蒸馏水冲洗干净晾干备用.在洗净、烘干、铺好滤纸的9 cm 培养皿中，分别加入8 mL 的蒸馏水和20% PEG[21]模拟正常萌发和渗透胁迫.每个培养皿30 粒种子，均匀摆放在充分浸润的滤纸上，置于光照培养箱中培养.首先暗培养3 d，然后在光照12 h、温度为25 ℃，黑暗12 h、温度为20 ℃条件下继续培养4 d.分别于培养3、5 d 和7 d 后取样，每组每个时间点设3 次生物学重复，每个重复取5株长势一致的幼苗.取样后，迅速放入液氮中，取出后保存在-80 ℃超低温冰箱中备用.

1.2 RNA 提取和cDNA 合成称取50～100 g 样品，用液氮将其研磨至粉末状，使用TransZol Up Plus RNA Kit 试剂盒(全式金生物有限公司)进行RNA 提取.RNA 的完整性在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，其浓度及质量则利用NanoReady F-1100 进行测定.cDNA 反转录使用MonScript™ RTIII Super Mix with dsDNase(Two-Step)试剂盒(莫纳生物科技有限公司)，按照试剂盒说明书进行操作，于-20 ℃冰箱保存.

1.3 引物合成根据文献报道的大麻内参基因研究的结果[19-20,22]，选取钙依赖蛋白激酶基因(calcium-dependent protein kinase,CDPK)、肌动蛋白基因(actin,ACT)、网格蛋白基因(Clathrin)、真核生物翻译起始因子基因4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)、转录延伸因子基因(elongation factor 1-α,EF1α)、蛋白磷酸酶2A 基因(protein phosphatase 2A,PP2A)、液泡膜内在蛋白基因(tonoplast intrinsic protein 41,TIP41)、微管蛋白基因(β-tubulin,TUB)、多聚泛素酶基因(ubiquitinprotein ligase,UBQ)、DAHP 合成酶同工酶基因(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase isoenzyme 2,DHS2)10 个基因作为候选内参基因(表1)，引物合成交由昆明擎科生物科技有限公司完成.

表1 工业大麻10 个候选内参基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of 10 candidate reference genes in industrial hemp

1.4 qRT-PCR 反应条件使用MonAmpTMSYBR®Greeb qPCR Mix(Low Rox)试剂盒(莫纳生物科技有限公司)在实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex)上对内参基因的表达量进行检测.反应体系20 μL，包括MonAmpTMSYBR®Greeb qPCR Mix10 μL，cDNA 溶液1 μL，正向引物和反向引物各0.4 μL 以及Nuclease-Free Water 8.2 μL.扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 秒，40 个循环；每个反应设置3 次重复.溶解曲线使用仪器默认采集程序.

1.5 引物特异性鉴定与扩增效率计算将‘云麻7 号’种子正常萌发与渗透胁迫处理下萌发的样品cDNA 进行等量混合，混合后的原液再稀释51、52、53、54倍，加上不稀释共设置5 个梯度，进行qRTPCR 反应.标准曲线是以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标，对应浓度的Ct（cycle threshold）值作为纵坐标，从而获得对应的斜率(k)及其线性相关系数(R2)，扩增效率(E)则由公式E(%)=10-1/k-1 计算得出.

利用1%琼脂糖凝胶电泳对10 个内参基因qRT-PCR 产物进行初步检测，同时结合溶解曲线来确定引物的特异性.对特异性较好的内参基因引物进行后续qRT-PCR 反应，条件同1.4 节.

1.6 数据处理与内参基因稳定性评价相关数据利用Excel 2016 进行统计和整理.分别使用3 种不同软件[23]（geNorm、NorFinder 和BestKeeper）对内参基因的表达稳定性进行分析，得到在正常萌发与渗透胁迫处理下萌发各候选内参基因的表达稳定性.最后，内参基因的稳定性通过在线软件RefFinder进行综合评价.通过geNorm 和NorFinder 软件进行分析时，先找到该基因在所有样品中最小的Ct 值，再用其他样品的Ct 值减去最低Ct 值，从而得到ΔCt 值，利用Excel 中的函数计算出相应样品和基因的2-ΔCt值即为相对表达量.

2 结果与分析

2.1 总RNA 质量检测使用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的6 组不同处理与时间工业大麻萌发幼苗的总RNA(图1)，28S 和18S 条带清晰明亮，且28S 的亮度约等于18S 两倍，结果说明RNA 未出现降解，完整性较好.使用NanoReady 2000 进行纯度检测，A260/A280值在1.9～2.2 之间，表示RNA 纯度较高，无明显蛋白质、多糖等污染，可以进行后续试验.

图1 不同萌发时间工业大麻幼苗总RNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection of total RNA in industrial hemp seedling at different germination times

2.2 内参基因引物筛选内参基因的扩增效率及相关系数分析结果表明，候选内参基因中除了EF1α扩增效率为114.88%，高于110%，其余都在90%～110%之间.所有候选内参基因线性相关系数R2均在0.995 9～0.999 9，表明以上引物具有很强的特异性和良好的扩增效率(表2).其中，DHS2基因qRT-PCR 结果不具有线性关系，剔除此候选内参基因.内参基因引物特异性的电泳检测结果表明，CDPK基因在500 bp 附近还出现1 条条带，特异性不好，剔除此内参基因.其余8 个内参基因的目标扩增条带大小正确，无其它非特异性条带(图2)，可以继续进行后续试验.

图2 工业大麻9 个候选内参基因荧光定量PCR 产物的电泳检测Fig.2 Electrophoresis detection of qRT-PCR amplification products of 9 candidate reference genes in industrial hemp

表2 候选内参基因的扩增效率和相关系数Tab.2 The amplification efficiency and correlation coefficient of candidate reference genes

2.3 候选内参基因表达分析根据qRT-PCR 检测结果，对8 个候选内参基因的Ct 值进行统计.从整体上看，所有内参基因的Ct 值介于19～29 之间(图3)，范围较广.其中，表达水平受处理条件与时间影响较大的为Actin基因，最大和最小值之间相差3.64.Clathrin和TUB的Ct 值最大值和最小值差值分别为2.52 和2.21.eIF4E、TIP41、UBQ、EF1α、PP2A在所有样品中的稳定性较好，最大值和最小值差值在1.21～1.53 之间.

图3 工业大麻8 个候选内参基因的Ct 值Fig.3 The Ct values of 8 candidate reference genes in industrial hemp

2.4 工业大麻种子萌发及其在渗透胁迫下候选内参基因的表达稳定性

2.4.1 geNorm 软件分析 geNorm 软件以M=1.5为默认阈值，M值越小，越稳定，当M＞1.5 时，则认为该基因不稳定.从表3 可以看出，8 个内参基因的M值均小于1.5，均可能是适合的内参基因.其中，在工业大麻种子正常萌发阶段，PP2A与TIP41基因表达稳定性最好，Actin、TUB表达稳定性最低.在渗透胁迫处理下萌发，eIF4E和UBQ基因表达稳定性最好，TUB、Clathrin表达稳定性最差.综合两种处理，eIF4E、EF1α基因表达稳定性最好，TUB、Actin表达稳定性最差.

表3 geNorm 软件分析内参基因的平均表达稳定性值(M)Tab.3 Average expression stability of reference genes calculated by geNorm

同时，根据geNorm 软件分析内参基因的标准化因子配对差异值，确定该试验所需要的最适内参基因数目，当Vn/n+1＜1.5，则最适数目为n；当Vn/n+1＞1.5，则最适数目为n+1.分析结果表明，工业大麻种子正常萌发或渗透胁迫处理下萌发配对差异值Vn/n+1均小于0.15，说明种子正常萌发或渗透胁迫下萌发选择2 个内参基因就可满足试验需求，结果稳定可靠(表4).

表4 geNorm 软件分析内参基因的标准化因子配对差异值(Vn/n+1)Tab.4 Pairwise variations of normalization factors(Vn/n+1) of reference genes calculated by geNorm

2.4.2 NormFinder 软件分 析 NormFinder 软 件是根据组内方差和组间方差对内参基因的稳定性进行评估，给出每个内参基因相应的表达稳定值(S)，S值越低，则表达越稳定.评估结果表明(表5)，8 个候选内参基因在工业大麻种子正常萌发下eIF4E最稳定，而渗透胁迫处理下萌发UBQ最稳定，综合比较两者得出eIF4E内参基因表达最稳定.

表5 基于NormFinder 和Bestkeeper 软件对候选内参基因扩增效率及表达稳定性的分析Tab.5 Analysis of amplification efficiency and expression stability of candidate reference genes by NormFinder and Bestkeeper softwares

2.4.3 BestKeeper 软件分析 BestKeeper 软件判定内参基因的稳定性是通过计算候选内参基因的Ct 值，获得其标准偏差(SD)和变异相关系数(CV).变异系数和标准偏差越低，则内参基因就越稳定，反之，则越不稳定.由BestKeeper 软件分析可知(表5)，在工业大麻种子正常萌发中，UBQ、TIP41内参基因表达最稳定.在渗透胁迫处理下萌发，UBQ、EF1α内参基因表达最稳定.综合两组结果，EF1α、eIF4E内参基因表达最稳定.

2.4.4 RifFinder 软件的综合评价 RifFinder 分析工具根据每种软件的分析结果为单个基因分配适当的权重，对不同软件的分析结果进行综合分析.RifFinder 评价结果显示，8 个候选内参基因的表达稳定性在工业大麻种子正常萌发处理中的排序 为：PP2A＞TIP41＞eIF4E＞UBQ＞EF1α＞Clathrin＞TUB＞Actin；在渗透胁迫下萌发处理中的排序为：UBQ＞EF1α＞eIF4E＞PP2A＞TIP41＞Actin＞Clathrin＞TUB；综合两组结果的排序：eIF4E＞EF1α＞TIP41＞UBQ＞PP2A＞Clathrin＞Actin＞TUB.

3 讨论

种子萌发是植物生长早期最关键、最敏感的时期，容易受到逆境环境的影响.工业大麻由于特殊的种植地点，其种子萌发和生长发育易受到干旱、盐碱等渗透胁迫的影响.qRT-PCR 技术广泛应用于基因的表达分析，但选择表达稳定性高的内参基因是其结果准确的基础.在关于渗透胁迫下种子萌发的研究中，最适内参基因的选择存在较大的差异.在草果(Amomum tsaoko)种子不同休眠解除阶段UBCE2为理想内参基因[24]；ACT是蚬壳花椒(Zanthoxylum dissitum)种子萌发时期最合适的内参基因[25]；在低氧条件下水稻(Oryza sativa)萌发过程中GAPDH被发现是最适合的参考基因[26]；APM基因在落叶松(Larix kaempferi)不同器官和发育阶段(体细胞胚胎发生和种子萌发)中最稳定[27]；ACT是芝麻(Sesamum indicum)种子萌发阶段最适合的内参基因[28]；药用植物甘草(Glycyrrhizaspp.)渗透胁迫下叶中表达最稳定的基因为TIF1，根中为DNAJ[29]；中间锦鸡儿(Caragana intermedia)在渗透胁迫下UNK1、UNK2和PP2A在根中表达最稳定，TIP41和PP2A组合在叶中表达最稳定[30]；在干旱等渗透胁迫条件下，EF1α和sec3是马铃薯(Solanum tuberosum)中表达最稳定的基因[31]；菠菜(Spinacia oleracea)在PEG 胁迫下ELF1B基因表达稳定性最好[32]；冬瓜(Benincasa hispida)在高温和干旱胁迫处理下UBQ和TUA表达稳定性最好[33]；干旱和盐胁迫下野生大麦(Hordeum vulgaressp.Spontaneum)和栽培大麦(Hordeum vulgaressp.Vulgare)叶片中ubiquitin、ACT和ARF1 适宜作为内参基因组合进行实时定量PCR 研究[34]；多年生黑麦草(Lolium perenne)在干旱、盐、热胁迫及ABA 处理下，eIF4A基因表达稳定性最高[35].以上研究说明内参基因的选择随着物种、组织及处理条件的不同而变化.

据先前的文献报道，本研究选择了10 个候选内参基因(CDPK、eIF4E、TIP41、UBQ、EF1α、PP2A、Actin、Clathrin、TUB、DHS2)，研究其在渗透胁迫处理和正常处理下工业大麻不同萌发时间阶段中的表达稳定性，结果发现内参基因的稳定性在不同的试验处理下会出现差异.试验中CDPK和DHS2基因在‘云麻7 号’中的引物特异性较差，其余8 个候选内参基因Ct 值介于19～29 之间，处于正常范围，满足试验要求.利用专业分析软件(geNorm、NormFinder 和Bestkeeper)对8 个候选内参基因进行分析，结果发现，由于各个程序的计算方法原理不同，各软件得出的稳定性结果存在差异.geNorm软件分析结果显示在不同分组中，内参基因的选择有所差异，但其V2/3值均小于0.15，表明2 个内参基因的组合就可以实现稳定归一化.NormFinder 软件分析结果表明，eIF4E是工业大麻种子正常萌发与渗透胁迫下萌发不同时间段中最稳定的内参基因.BestKeeper 软件分析结果也存在差异，可能是由于BestKeeper 软件是直接对内参基因Ct 值进行分析.因此，利用RifFinder 软件进行综合分析排序，在工业大麻种子正常萌发阶段PP2A最稳定，渗透胁迫处理下萌发中UBQ最稳定，综合两组结果eIF4E最稳定.试验结果进一步说明了，内参基因的选择会随着试验条件的变化而变化.

综上所述，本研究分析了工业大麻种子正常萌发与渗透胁迫处理下不同萌发时间段中10 个候选内参基因的表达稳定性，最终确定在工业大麻种子正常萌发阶段，PP2A内参基因表达最稳定，在渗透胁迫处理下萌发中，UBQ内参基因表达最稳定，而综合两组来看，eIF4E内参基因表达最稳定.