普通野生稻内生细菌的分离鉴定及其对多年生稻的促生效果

马永海，田青霖，龚禹瑞，薛治峰，张廷萍，李丽萍，杨红敏，黄立钰，胡凤益，秦世雯

(云南大学 资源植物研究院/农业农村部多年生稻生物学与种质创新重点实验室，云南 昆明 650091)

普通野生稻（Oryza rufipogon）是亚洲栽培稻（Oryza sativaL.）的野生近缘种，经过长期自然选择积累了丰富的生境和遗传多样性，为栽培稻育种提供了宝贵的基因资源[1-2].普通野生稻在中国分布范围广，能够抵御干旱[3]、盐碱[4]、寒冷[5]、重金属[6]、白叶枯病[7]、稻曲病[8]、南方水稻黑条矮缩病[9]、稻飞虱[10]等非生物和生物逆境胁迫.研究还发现，普通野生稻具有丰富的内生细菌和和根际微生物多样性[11-13]，说明普通野生稻的遗传基础和微生态对其生境和胁迫适应性起到了至关重要的作用.

植物内生细菌（endophyte bacteria）是植物微生态系统的重要组成部分，与寄主协同进化，在植物的生长发育过程中起到重要作用[14].植物内生细菌通过溶磷、解钾和固氮作用帮助寄主植物吸收营养，分泌植物生长激素（吲哚乙酸、生长素、赤霉素等）促进寄主生长，以产生铁载体、ACC 脱氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase）、抗菌物质、诱导植物系统性抗性等方式帮助植物抵御胁迫干扰[15].目前研究表明，在胁迫环境（干旱、寒冷、高温、盐碱、污染等）下生长的植物，其内生菌回接到寄主或非寄主植物中，可以显著提高植物在逆境条件下的生长[16-17].因此，植物内生细菌在农业生产和环境保护方面具有广阔的应用潜力，但目前对普通野生稻内生细菌的挖掘和功能研究尚少.

多年生稻（perennial rice）是指播种一次可实现多年（季）持续收获的新型稻作品种，其“一种多收”的生产模式简化了购种、育秧、犁田、耙田、移栽等生产环节，大大减少了劳动力和水资源投入，具有显著的社会、经济和生态环境效应[18].由于多年生稻的连作生产方式，需采取恰当的施肥方式以保障多年生稻的生产优势.绿色、环保、持效期长的微生物菌肥契合了多年生稻高效、免耕、轻简的生产模式，还能够缓解多年生稻生产存在的冷害、干旱和病虫害问题[19].针对多年生稻微生物菌肥还处于空白的研究现状，本研究通过挖掘云南的元江普通野生稻内生细菌，明确其促生功能和对多年生稻的促生效果，为普通野生稻微生态功能研究和多年生稻微生物菌肥的研发奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料云南元江普通野生稻（Oryza rufipogon）、多年生稻粳型品种“PR23”和籼型品种“云大107”均由农业农村部多年生稻生物学与种质创新重点实验室提供.

1.2 内生细菌的分离纯化与保存采取云南特有的元江普通野生稻健康根、茎、叶组织，冲洗表面污渍.用75%酒精浸泡2～5 min，无菌水漂洗1 次，2.5%次氯酸钠浸泡2～4 min，无菌水漂洗3 次.组织研磨后将研磨液进行10-2～10-5梯度稀释，取100 μL 稀释液涂布于NA 培养基[20].吸取第3 次漂洗液涂布于NA 培养基，若无菌落产生表明组织表面彻底消毒干净，组织研磨液可用于分离内生细菌.28°C 黑暗倒置培养24～72 h 待细菌菌落长出，挑取形态不同的细菌菌落进行纯化和保存.

1.3 内生菌促生功能测定

1.3.1 溶磷能力测定 采用平板法，在无机磷培养基[21]和有机磷培养基[21]上放置灭菌滤纸片，每个滤纸片上接种5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接种等量的NB 培养液作为对照，28 ℃倒置培养24～72 h 后观察是否形成透明圈.根据透明圈和菌落圈比值（Mp）判断其解磷能力，Mp=透明圈直径/菌落圈直径，重复测算5 个处理取平均值（下同）.

1.3.2 固氮作用测定 采用划线法，在Ashby 培养基[21]上接种内生细菌，以NB 培养液作对照，28 ℃倒置培养24～72 h，能够稳定生长的菌株视为固氮菌.用天根细菌基因组DNA 提取试剂盒提取固氮菌株的DNA，随后利用Zehrf（5′-TGYGAYCCNAARG CNGA-3′）和Zehrr（5′-NDGCCATCATYTCNCC-3′）引物[22]，对固氮菌的固氮酶nifH基因进行PCR 扩增和测序.PCR 反应体系（25 μL)：10×Ex Taq PCR Buffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 1 μL，Ex Taq 酶（3 U/μL) 0.5 μL，无菌dd H2O 17 μL.PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环，72 ℃延伸5 min.

1.3.3 产铁载体能力测定 采用平板法，在铬天青（chrome azurol S,CAS）培养基[20]上放置灭菌滤纸片，每个滤纸片上接种5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接种等量NB 培养液作对照，28 ℃倒置培养24～72 h 后观察是否有橙黄色变色圈，根据Mp值判断其产铁载体能力.

1.3.4 产吲哚乙酸能力测定 吲哚乙酸定性分析采用Salkowski 比色法测定，将菌株接种至King’s B 培养基[23]中，28 ℃、200 r/min 振荡培养48 h.吸取等体积菌悬液和Salkowski’s 试剂[24]混合后放置于白色点滴板上，阳性对照为50 mg/L 吲哚乙酸，阴性对照为King B 培养基.避光反应30 min 后呈现粉红色说明菌株能产生IAA.

IAA 定量测定：配制质量浓度为10～60 mg/L的IAA 标准品溶液，分别与Salkowski’s 试剂等体积混合，25 ℃避光反应30 min，测定OD530nm值，绘制标准曲线.将上述定性测定中具有产IAA 功能的菌株接种于King’s B 培养基中，设置3 个重复，28 ℃、200 r/min 振荡培养48 h 后，10 000 r/min 离心.取上清液与Salkowski’s 显色剂等体积混合，25 ℃避光反应30 min，测定OD530nm值.King B 培养基与Salkowski’s 试剂等体积混合为空白对照.根据IAA 标准曲线方程y=0.019 5x-0.012 9，R2=0.995 3计算菌株的IAA 分泌量.

1.4 菌株的形态学观察和分子鉴定将菌株在NA平板培养基上划线，于37 ℃培养24 h 后观察其形态特征.菌株在NB 培养基中，37 ℃，200 r/min 振荡培养16～24 h 后进行革兰氏染色和菌体形态特征观察.利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取菌株DNA，进行16S rRNA 基因全长序列（引物序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）的PCR 扩增.PCR产物测序后在NCBI 数据库进行BlastN 比对.菌株16S rRNA 基因序列提交至国家基因组科学数据中心GenBase 数据库（https://ngdc.cncb.ac.cn/genbase/）获得相应登录号.利用MEGA 11 软件的邻接法（Neighbor-Joining Algorithm）构建16S rRNA序列的系统发育树，Bootstrap 值为1 000.

1.5 促生效果测定选取籽粒饱满、长势一致的多年生稻“PR23”和“云大107”种子，用2.5%次氯酸钠浸泡10 min 进行消毒.分别以浸种和拌土的方式进行温室促生试验.浸种处理：配置108cfu/mL的菌株悬液浸泡种子12 h，对照以无菌水进行浸泡，催芽至漏白，随后播种于苗盘中.拌土处理：将30 mL 108cfu/mL 的菌株悬液与500 g 灭菌土中混合均匀，放置于苗盆中，将催芽至漏白的种子播种于苗盘中.每盆9 粒种子，每个处理3 个重复.待多年生稻长至三叶一心期测定株高、根长、鲜重、叶绿素和氮素含量.

1.6 数据处理数据利用SPSS 17 软件进行统计分析，以单因素方差分析和Duncan’s 法检验数据差异显著性，利用Graphpad Prism 8.0 软件绘图.

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离纯化本研究分别从元江普通野生稻的根、茎、叶3 个组织中分离获得52、32和27 株内生细菌，共111 株.根部分离获得的内生细菌数量最多，说明根部内生细菌种类和丰度高于其他组织.

2.2 内生细菌的促生功能

2.2.1 溶磷能力 具有溶磷功能的内生细菌可以将无机磷和有机磷培养基中难溶性磷转变为可溶性磷，使得菌落周围出现明显的透明圈[图1（a）和1（d）].分离内生细菌中50 株具有溶无机磷能力[图1（b）]，32 株具有溶有机磷能力[图1（e）].溶无机磷能力的菌株Mp值在1.14～1.92，溶有机磷能力的菌株的Mp值在1.16～2.03，且3 个组织中分离的内生细菌溶磷能力（Mp值）无显著差异[图1（c）和图1（f）].

图1 普通野生稻具有溶磷功能的内生细菌数量及其Mp 值Fig.1 Number and Mp values of endophytic bacterial strains with phosphate-solubilizing ability isolated from Oryza rufipogon

2.2.2 固氮作用 分离的内生细菌中共有能够23 株能够在Ashby 培养基上稳定生长[图2（a）和2（b）]，并且均能扩增出固氮酶基因nifH[图2（c）]，说明23 株细菌可通过固氮酶基因nifH发挥固氮作用.

2.2.3 产铁载体 分离的内生细菌中共有50 个菌株可以使菌株周围的蓝色CAS 培养基变成橙黄色[图3（a）和3（b）]，Mp值在1.17～4.88，说明其具有产铁载体能力，且3 个组织中分离的内生细菌产铁载体能力（Mp值）无显著差异[图4（c）].

图3 普通野生稻产铁载体内生细菌的数量及其Mp 值Fig.3 Number and Mp values of endophytic bacterial strains with siderophore-producing activity isolated from Oryza rufipogon

图4 普通野生稻中产吲哚乙酸内生细菌的数量及分泌量Fig.4 Number of screening endophytic bacterial strains with IAA productivity isolated from Oryza rufipogon and their IAA yields

2.2.4 产吲哚乙酸 利用吲哚乙酸IAA 显色反应发现，分离的内生细菌中共有18 株菌株可使反应液呈现粉红色[图4（a）和4（b）]，18 株菌株IAA分泌量在0.73～24.62 mg/L，且3 个组织中分离的菌株的IAA 分泌量无显著差异[图4（c）].来自于叶部的ORL3-1 以及来自于茎部的ORS1-2 和ORS2-5 菌株IAA 分泌量显著高于其他菌株，分别为（24.62 ±0.01）、（22.81 ± 0.07）mg/L 和11.69 ± 0.05 mg/L，说明3 个菌株具有较高的IAA 分泌能力.

2.3 菌株的鉴定选取溶无机磷、固氮、产铁载体和IAA 的ORL3-1，产IAA 和铁载体的ORS1-2以及固氮和产IAA 的ORS2-5 菌株进行形态学和分子鉴定.结果发现，ORS1-2 菌株属于革兰氏阴性细菌，杆状，菌体大小为(0.6～0.8) μm×(2.0～3.0) μm[图5（b）]；在NA 培养基上单菌落为乳白色，圆形，无凸起，表面光滑，边缘整齐，菌落直径为4.0～5.0 mm[图5（a）].ORS1-2 菌株（GenBase 登录号：C_AA001297.1）与路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigiistrain IB5 菌株（GenBank 登录号：MK370571.1）的16S rRNA 基因序列相似性为100%，且亲缘关系最近[图5（c）]，鉴定为路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）.ORL3-1 菌株属于革兰氏阴性细菌，杆 状，菌体大小为(0.8～1.0) μm×(2.5～3.0) μm[图5（b）]；在NA 培养基上单菌落为乳白色，圆形，无凸起，表面光滑，边缘整齐，菌落直径为6.0～7.0 mm[图5（a）].ORL3-1 菌株（GenBase 登录号：C_AA001296.1）与水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzaestrain NAC43 菌株（GenBank 登录号：MK872330.1）的16S rRNA 基因序列相似性为99.93%，且与其共处同一进化分支[图5（c）]，鉴定为水稻科萨克氏菌（Kosakonia oryzae）.ORS2-5 菌株属于革兰氏阳性细菌，杆状，菌体大小为(0.8～1.2) μm×(4.0～6.0) μm[图5（b）]；在NA 培养基上单菌落为乳白色，圆形，有凸起，表面不光滑，边缘整齐，菌落直径为2.0～3.0 mm[图5（a）].ORS2-5 菌株（GenBase 登录号：C_AA001299.1）与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisstrain HY-119 菌株（GenBank 登录号：MZ895453.1）的16S rRNA 基因序列相似性为100%，且亲缘关系最近[图5（a）]，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）.

图5 ORS1-2、ORL3-1 和ORS2-5 菌株的鉴定及其系统发育树Fig.5 Morphological identification of strains ORS1-2,ORL3-1 and ORS2-5 and their phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences

2.4 菌株对多年生稻的促生效果利用菌株浸种及拌土处理后，将多年生稻栽种至三叶一心期后发现，ORS1-2 菌株、ORS2-5 菌株和ORL3-1 菌株对多年生稻粳型品种“PR23”和籼型品种“云大107”均具有不同程度促生效果（图6）.ORS1-2 菌株浸种处理可显著提高PR23 的根长，拌土处理可显著提高PR23的根长、叶绿素含量和氮素质量比；ORS2-5 菌株浸种和拌土处理均可显著提高PR23 的根长、鲜重、叶绿素含量和氮素质量比；ORL3-1 菌株浸种和拌土处理均可显著提高PR23 的根长（表1）.ORS1-2 菌株浸种处理可显著提高“云大107”的根长、鲜重、叶绿素含量和氮素质量比，拌土处理可显著提高“云大107”的根长；ORS2-5 菌株浸种和拌土处理均可显著提高“云大107”的根长、鲜重、叶绿素含量和氮素质量比；ORL3-1 菌株浸种和拌土处理均可显著提高“云大107”的根长、鲜重、叶绿素含量和氮素质量比（表2）.以上结果说明路德维希肠杆菌ORS1-2 菌株、枯草芽孢杆菌ORS2-5 菌株和水稻科萨克氏菌ORL3-1 菌株能够促进多年生稻的细胞伸长、光合作用和生物量积累.

表2 ORS1-2、ORL3-1 和ORS2-5 菌株对多年生稻“云大107”的促生效果Tab.2 Effect of strains ORS1-2,ORL3-1 and ORS2-5 on perennial rice Yunda107

图6 ORS1-2、ORL3-1 和ORS2-5 菌株对多年生稻的促生效果Fig.6 Effect of strains ORS1-2,ORL3-1 and ORS2-5 on perennial rice growth

3 结论与讨论

植物内生细菌通过多种机制帮助植物抵御生物和非生物胁迫，并促进寄主生长，具有开发成微生物农药和菌肥的巨大潜力.野生稻是农业微生物资源的重要保藏库，已有研究从南方野生稻[23]、澳洲野生稻[25]、尼瓦拉野生稻[26]、药用野生稻[27-28]、普通野生稻[29-30]中筛选到具有促生功能的内生细菌.同时，已有研究从我国广东、海南和东乡普通野生稻中挖掘出了促生功能的内生细菌，且研究重点集中在固氮和溶磷内生细菌[29-30].本研究首次从云南元江普通野生稻中筛选到82 株溶磷能力的内生细菌，23 株固氮内生细菌，50 株产铁载体内生细菌，18 株产IAA 内生细菌，分别占总分离菌株数量的73.87%、20.72%、16.22%和45.05%，且根部分离获得的菌株数量较茎部和叶部多.研究发现，东乡野生稻可培养内生细菌在根部的数量和多样性相对于叶部和茎部较高[12]，与本研究菌株分离结果一致，这与土壤根际微生物效应有关[31].促生菌株是否能在植株体内稳定发挥促生作用跟其定殖效率密切相关，IAA 分泌能力被认为是具有高定殖效率的水稻促生细菌特征，可依据菌株IAA 分泌量进行水稻促生菌的高效筛选[32]，因此本研究选取了3 个IAA 分泌量较高的菌株进行多年生稻促生效果分析.

目前研究从不同生境下的普通野生稻中分离的内生细菌对水稻具有促生效果.分离自海南陵水的普通野生稻根部的内生柠檬酸杆菌（Citrobacter amalonaticus）Ls16 和Ls20 菌株具有固氮功能，对水稻籼型品种“华航1 号”具有显著促生效果[30].分离自印度普通野生稻茎部的内生微杆菌Microbacterium laevaniformansRS0111 菌株高 产IAA 和赤霉素，可显著提高水稻品种“迪昌”（Dichang）的产量[33].本研究筛选到的枯草芽孢杆菌ORS2-5 菌株对多年生稻粳型品种“PR23”和籼型品种“云大107”均具有较好的促生效果，而水稻科萨克氏菌ORL3-1 菌株和路德维希肠杆菌ORS1-2 菌株对“云大107”具有较好的促生效果.说明普通野生稻不同种类的内生细菌对水稻品种具有寄主选择性.枯草芽孢杆菌是目前商业化最为成功的生防微生物之一，在多种单子叶和双子叶作物上均具有良好的促生和防病效果[34].水稻科萨克氏菌和路德维希肠杆菌在水稻生防方面的研究还较少.因此深入研究不同种类内生细菌介导的促生机制和寄主选择性，将有助于定向改善水稻对环境的适应性及其生产力，为水稻生物育种及增产提供新途径.

植物种子内生菌群是建立植物内生菌群的基础，种子内生菌群能够随着种子萌发转移至幼苗，促进寄主生长发育[35].本研究采用菌株浸种和拌土方法构建多年生稻种子内生菌群，结果发现，路德维希肠杆菌ORS1-2 菌株浸种和拌土处理对多年生稻的促生效果存在显著差异，这可能是由于两种处理对该菌株的定殖效果存在一定影响.因此，针对不同菌株不仅需考虑其寄主选择性，还需采取适宜的接种方法，才能建立有效的促生微生态.本研究筛选的促生菌株将为多年生稻生态菌肥提供菌种资源，搭配合理的播种和田间管理措施，可精准培育“多年生稻-微生物共生体”.未来还需深入分析促生菌株的大田长期效应及其对多年生稻农业生态的影响，构建“促生微生物组”，助力多年生稻绿色轻简化的生产模式.