荣筋拈痛方对膝骨关节炎大鼠软骨组织Beclin1及LC3B表达的影响

李路 王文义 潘丹虹 林晴 付长龙 郑春松 马德尊 叶锦霞

【摘 要】目的：觀察荣筋拈痛方对膝骨关节炎大鼠软骨组织自噬的影响，探讨其防治膝骨关节炎的作用机制。方法：将24只SD大鼠按照随机分层法分为假手术组、模型对照组、荣筋拈痛方组，每组8只。除假手术组外，其他组采用改良Hulth法复制膝骨关节炎模型。给药12周后，从假手术组和模型对照组中随机抽取3只大鼠拍摄膝关节MRI，观察模型是否成功。采集大鼠膝关节组织，HE染色法观察软骨组织形态结构，采用Mankin病理评分对关节软骨进行组织形态学评分；免疫组织化学法观察软骨组织酵母自噬相关基因6同源物（Beclin1）及微管相关蛋白Ⅰ轻链3B（LC3B）的定位与表达。结果：MRI显示，假手术组关节间隙正常，关节面平整；模型对照组关节间隙增宽，关节软骨面不平整、局部缺损，结缔组织增生，骨赘形成。荣筋拈痛方组大鼠骨关节炎模型关节软骨的大体外观及HE染色均改善明显，Mankin软骨评分高于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。荣筋拈痛方组自噬蛋白Beclin1及LC3B表达均呈上升趋势。结论：荣筋拈痛方可能通过提高自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达，改善软骨细胞状态，延缓关节软骨退变。

【关键词】 膝骨关节炎；荣筋拈痛方；软骨组织；自噬；大鼠

Effect of Rongjin Niantong Fang（荣筋拈痛方）on the Expression of Beclin1 and LC3B in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis

LI Lu，WANG Wen-yi，PAN Dan-hong，LIN Qing，FU Chang-long，ZHENG Chun-song，MA De-zun，YE Jin-xia

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rongjin Niantong Fang（荣筋拈痛方）on autophagy of cartilage tissue in rats with knee osteoarthritis，and explore its mechanism of prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：Twenty four SD rats were randomly stratified into a sham operation group，a model control group，and a Rongjin Niantong Fang group，with 8 rats in each group.Except the sham operation group，other groups used the improved Hulth method to replicate knee osteoarthritis models.After 12 weeks of administration，3 rats were randomly selected from the sham operation group and the model control group to take MRI images of knee joint and observe whether the model was successful.Collect knee joint tissue from rats，observe the morphology and structure of cartilage tissue using HE staining method，and score the tissue morphology of joint cartilage using Mankin pathological score;immunohistochemical method was used to observe the localization and expression of yeast autophagy related gene 6 homolog（Beclin1）and microtubule associated protein I light chain 3B（LC3B）in cartilage tissue.Results：MRI showed that the joint space in the sham operation group was normal and the joint surface was flat;in the model control group，the joint space widened，the articular cartilage surface was uneven with local defects，and there were connective tissue hyperplasia，and osteophyte formation.The general appearance and HE staining of the articular cartilage in the Rongjin Niantong Formula group of rats with osteoarthritis model improved significantly，and the Mankin cartilage score was higher than the model control group，with a statistically significant difference（P < 0.01）.The expression of autophagy proteins Beclin1 and LC3B in the Rongjin Niantong Fang group showed an upward trend.Conclusion：Rongjin Niantong Fang may improve the state of chondrocytes and delay joint cartilage degeneration by increasing the expression of autophagy related proteins Beclin1 and LC3B.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Rongjin Niantong Fang（荣筋拈痛方）;cartilage tissue;autophagy;rats

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种关节退行性疾病，其发病特征以膝关节肿痛、关节软骨进行性退变、軟骨下骨逐渐硬化为主［1］。随着老龄化进程加速，KOA发病率日益提高，给家庭和社会造成了很大的负担。现代研究表明，软骨细胞自噬与KOA的发生、发展联系密切［2-3］。前期临床研究发现，荣筋拈痛方治疗KOA疗效确

切［4］，体外实验也发现荣筋拈痛方可调节白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的软骨细胞自噬水平，改善软骨细胞炎症状态［5］。本研究通过观察荣筋拈痛方对KOA大鼠软骨组织自噬的影响，探讨其防治KOA的作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 2月龄SPF级雄性SD大鼠24只，体质量（160±20）g，购自杭州医学院，实验动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0002。饲养环境设施由福建中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK（闽）2019-0007。实验动物的处理方式符合伦理学要求。

1.2 药 物 荣筋拈痛方（由牛膝、当归、羌活、独活、防风、甘草组成，专利号ZL20171028 4659.8）；荣筋拈痛方颗粒（江阴天江药业有限公

司，批号2006001），药物质量安全可控［4］。

1.3 试 剂 Beclin1一抗、LC3B一抗（批号bs-1353R、bs-4843R，北京博奥森生物技术有限公司）；二抗SP-9001试剂盒、DAB显色试剂盒（批号222510112、ZLI-9019，北京中杉金桥生物技术有限公司）；无水乙醇、中性树胶、二甲苯（批号100092683、10004160、10023418，国药集团化学试剂有限公司）；异氟烷（批号20092101，瑞沃德生命科技有限公司）；HE染色试剂盒（批号G1003，武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.4 仪 器 生物自动脱水机（型号ZT-14S，湖北省亚光医用电子技术有限公司）；生物组织自动包埋机（型号TB-718E，湖北泰维医疗科技有限责任公司）；石蜡切片机（型号RM2135，德国莱卡公司）；磁共振仪［型号BioSpec 7，布鲁克（北京）科技有限公司］；显微图像采集系统（型号DM4000B，德国Leica公司）；多功能真彩色细胞图象分析管理系统（Image-Pro Plus，美国Media Cybernetics公司）。

2 方 法

2.1 分组与动物模型制作 2月龄SPF级雄性SD大鼠24只，适应性喂养1周，采用随机分层法分为假手术组、模型对照组和荣筋拈痛方组，每组

8只。术前用体积分数为1.5%的异氟烷进行吸入性麻醉，模型对照组和荣筋拈痛方组采用改良Hulth法完成KOA造模。大鼠膝关节内侧入路，切断内侧副韧带、前交叉韧带，摘除内侧半月板［6］。假手术组仅划开双侧膝关节处皮肤，开口大小和模型对照组相同，随即缝合伤口。为预防感染，使用20万U的青霉素对大鼠进行肌注，并常规消毒

伤口。

2.2 药物干预 药物剂量按照人和动物药物临床等效剂量换算，荣筋拈痛方组剂量为1.9 g·kg-1·d-1，将荣筋拈痛方颗粒用生理盐水配制为溶液灌胃。假手术组、模型对照组均予等量质量分数为0.9%的生理盐水，按1 mL·（100 g）-1·d-1灌胃，持续12周。

2.3 大鼠膝关节MRI扫描 药物干预结束后，随机抽取假手术组、模型对照组大鼠各3只，拍摄膝关节MRI，观察KOA进展情况。采用异氟烷吸入性麻醉装置对大鼠进行持续麻醉，实时监测大鼠生命体征直至扫描完成。将大鼠仰卧位固定于检查板，膝伸直辅以软垫固定，环形表面线圈固定于关节正上方，线圈中心正对胫骨平台，采用冠状位和矢状面T2WI序列进行成像。T2WI序列采用TurboRARE序列，参数如下：TR = 4554.863 ms，

TE = 35.0 ms，层厚0.4 mm，矩阵320×320，FOV 30 mm×20 mm，扫面层数13层，平均次数

4次，扫描时间9 min 43 s 22 ms。

2.4 动物取材 各组大鼠术前用体积分数为1.5%的异氟烷吸入性麻醉成功后，取大鼠右侧膝关节股骨髁及胫骨平台以质量分数为4%的多聚甲醛固定48 h，再进行常规脱钙、脱水、透明，最后使用石蜡进行包埋，5 μm切片备染，进行苏木精-伊红染色（HE染色）和免疫组化检测。

2.5 指标检测

2.5.1 大体观察 各组动物处死后，取右侧股骨髁以及胫骨平台，对软骨面进行肉眼观察。

2.5.2 HE染色观察软骨组织形态并进行Mankin评分 组织切片进行HE染色，使用光镜观察软骨组织变化，并采集图片。每组随机选6张组织切片，对各组组织切片的形态进行Mankin评分［7］。

2.5.3 免疫组化观察关节软骨组织自噬蛋白Beclin1和LC3B的定位与表达 将各组石蜡包埋块切片、脱蜡、脱水，用质量分数为3%的H2O2孵育5 min；使用微波加热，进行抗原修复，使用山羊血清封闭液室温封闭。孵育一抗、二抗：在切片上滴加一抗，4 ℃过夜，滴加二抗（IgG），37 ℃

孵育20 min。DAB显色，苏木素复染1 min。乙醇梯度脱水、使用二甲苯进行透明［3］，最后使用中性树胶完成封片，200倍镜下随机选取5个视野，采用多功能真彩色细胞图像分析管理系统，分析所获取的图片并得出阳性细胞数百分率。每组随机选6只大鼠参与统计。阳性细胞数分级0～ < 1% =

0级、1%～10% = 1级、11%～ 50% = 2级、51%～ 80% = 3级、81%～ 100% = 4级。

2.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用ANOVA方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠一般情況 假手术组大鼠状态良好，模型对照组、荣筋拈痛方组大鼠术后1周出现自主活动减少、活动受限等现象，1周左右活动逐渐恢复正常，且荣筋拈痛方组大鼠表现优于模型对照组。实验结束后，假手术组大鼠膝关节外观形态正常，髌骨及髌韧带形态正常。模型对照组膝关节肿大较明显，侧面可见瘢痕增生组织形成。给予荣筋拈痛方后膝关节肿胀度减轻，骨赘增生明显减少。见

图1。

3.2 各组大鼠膝关节MRI观察 假手术组可见关节间隙正常，内外侧半月板结构完整，股骨髁和胫骨平台关节面平整。模型对照组关节间隙增宽，内侧半月板缺如，关节软骨面不平整、软骨层变薄、局部缺损，结缔组织增生，形成明显骨赘，关节肿胀、积液明显，模型制作成功。见图2。

3.3 各组大鼠膝关节组织形态学观察 各组股骨髁软骨组织的HE染色显示：假手术组关节软骨表面相对光滑完整，层次分明，结构完整；软骨细胞分布均匀，大小适中，无双核现象出现，潮线清晰可见。模型对照组关节软骨表面出现缺损，层次紊乱，结构破坏；软骨细胞形态异常，变小，分布紊乱，较多双核现象；潮线不清晰，扭曲或中断；呈现典型骨关节炎性改变。给予荣筋拈痛方后大鼠关节软骨退变程度明显好转，软骨表面较为光滑完整，层次有所改善，软骨细胞形态稍有异常，细胞变大，分布较均一，少量双核现象；潮线略不清晰。见图3。

3.4 各组大鼠膝关节软骨Mankin评分比较 与假手术组比较，模型对照组膝关节软骨Mankin评分显著增加，差异有统计学意义（P < 0.01）；荣筋拈痛方组虽Mankin评分增加，但差异无统计学意义（P ﹥ 0.05）。与模型对照组比较，荣筋拈痛方组Mankin评分降低，差异有统计学意义

（P < 0.01）。见表1。

表1 各组大鼠膝关节软骨Mankin评分比较   （分，）

组别 动物数/只 Mankin评分

假手术组 6         1.00±0.63

模型对照组 6         9.67±1.031）

荣筋拈痛方组 6         2.00±0.892）

注 与假手术组比较，1）P < 0.01；与模型对照组比较，2）P < 0.01。

3.5 各组大鼠膝关节软骨组织蛋白表达比较 光镜显微镜下，细胞核和细胞质及基质棕黄色或棕褐色为阳性，蓝染为阴性。与假手术组比较，模型对照组和荣筋拈痛方组软骨组织中Beclin1和LC3B阳性率明显降低（P < 0.01）；与模型对照组比较，荣筋拈痛方组Beclin1和LC3B阳性率有不同程度的提高（P < 0.01）。见表2，图4、图5。

表2 各组大鼠膝关节软骨组织蛋白表达差异比较

（%，）

组别 动物数/只 Beclin1阳性率 LC3B阳性率

假手术组 6   45.67±2.52   40.67±3.51

模型对照组 6     8.67±2.521）     7.33±0.581）

荣筋拈痛方组 6   20.33±6.662）   24.33±2.082）

注 与假手术组比较，1）P < 0.01；与模型对照组比较，2）P < 0.01。

4 讨 论

KOA是骨伤科临床常见退行性疾病，多发于中老年人，属中医学“痹证”“痿证”范畴。课题组从中医学“筋骨”理论出发，提出KOA病机为“本痿标痹”，主张补肝肾、益气血以治痿，祛风湿、止痹痛以治痹［8］，国医大师陈可冀院士基于中医“肝主筋、肾主骨”理论和对《清宫配方集成》中骨关节炎（osteoarthritis，OA）治疗方药数据挖掘基础上审定组方而成荣筋拈痛方，治疗OA具有较好的疗效。荣筋拈痛方由牛膝、当归、独活、羌活、防风和甘草组方。牛膝苦、甘、酸、平，归肝肾经。重用牛膝以补肝肾而壮筋骨，且牛膝能活血以通利肢节筋脉，为君药。臣以当归养血和血，以荣筋骨血脉。牛膝、当归，君臣相伍，补肝肾，壮筋骨，又兼活血，寓治风先治血，血行风自灭之意。独活善治伏风，除久痹，且性擅下行；羌活祛风湿，利关节，止痛；防风祛风胜湿止痛。三药相配，除一身之痹痛，以达祛风湿、止痹痛之效，为佐药。甘草善治四肢拘挛，缓急止痛，更调和诸药，为使药。诸药配合，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿和止痹痛之效，长期应用于痹证日久、肝肾两虚之OA的临床治疗，疗效确切。前期研究证实，荣筋拈痛方能有效缓解患者的症状及体征，延缓KOA的进展［4］，具有抑制炎症、抑制分解代谢、促进合成代谢的功效；同时，能调节软骨细胞自噬水平，减轻软骨细胞炎症［4］。本研究进一步探讨其在动物水平的作用。

本课题组前期研究发现，改良Hulth法建立的大鼠OA模型有以下优势：仅切断大鼠前交叉韧带，操作比较简单、创伤较小，可保持一定的膝关节稳定性，有利于成功复制动物模型［9］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型对照组关节间隙明显增宽，关节软骨面不平整、局部缺损，伴有骨赘增生，表明改良Hulth法建立的大鼠OA模型比较成功。荣筋拈痛方干预后，与模型对照组比较，膝关节肿胀度减轻，骨赘增生明显减少，HE染色也发现软骨表面较为光滑完整，软骨层次优于模型对照组，软骨细胞形态异常也有好转，明显减轻了软骨结构损伤，延缓了膝骨关节软骨退变。

自噬是一种维持真核细胞分解代谢稳态的重要途径［10］，是细胞进行“自我吞噬”的过程，在应激条件下，细胞器、大分子被吞噬直至分解，参与体内循环，维持细胞稳态。Beclin1是在自噬中起正调控作用的酵母Atg6同源物［11］，是自噬的关键调控因子，负责自噬体的成核，参与溶酶体的融合和降解，它的表达上调是自噬过程激活的重要标

志［12］。LC3B是自噬体标志性基因LC3的亚型之一，其含量随自噬泡的增加而增加，可作为自噬诊断指标［13］。Beclin1和LC3B的表达增加表明软骨细胞自噬能力增强。本实验免疫组化结果显示，模型对照组软骨组织中Beclin1和LC3B表达明显降低，说明KOA模型中自噬功能降低；而给予荣筋拈痛方后软骨组织中Beclin1和LC3B表达明显增高，表明提高了软骨细胞的自噬功能，减轻了软骨组织损伤。

综上所述，荣筋拈痛方可改善KOA大鼠软骨结构，延缓病理进程，提高自噬相关蛋白表达水平。KOA发生、发展过程中伴随着自噬的动态变化，本研究未能将荣筋拈痛方在KOA不同阶段对软骨细胞自噬水平的影响进行阐明，探讨其通过何种机制对软骨自噬产生影响。可进一步（下转第11页）

（上接第5页）进行病毒载体等实验，研究荣筋拈痛方对KOA的作用机制，有利于揭示KOA的发病机制，确立治疗的关键靶点，为其临床诊断与治疗提供参考。

参考文献

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收稿日期：2023-01-19；修回日期：2023-02-27