间充质干细胞来源外泌体治疗椎间盘退变的机制研究进展

杨超强 张虎林 汪小敏 王亮 王宜灿

【摘 要】 椎间盘退变是一种以髓核细胞凋亡减少、细胞外基质降解加速为主要病理特征，常伴随慢性腰痛或下肢神经根性疼痛等临床表现的脊柱疾病。随着再生医学的发展及椎间盘退变机制的不断研究，间充质干细胞来源外泌体作为一种用于细胞间通讯的活性生物物质，已被证实在椎间盘再生中具有治疗潜力。其可抑制炎症反应和调节免疫系统，促进髓核细胞增殖和再生，提高体外细胞外基质的生成，具有逆转或者中止椎间盘退变的潜能。综述间充质干细胞来源外泌体的生物学特性和功能及其在椎间盘退变治疗中的作用及机制，以期为后续研究和临床应用提供指导。

【关键词】 椎间盘退变；间充质干细胞；外泌体；下腰痛；机制；研究进展；综述

下腰痛（low back pain，LBP）是一种非常普遍的脊柱疾病，也是世界范围内导致残疾的主要原因。据统计，特定时间内，一般人群中LBP的平均患病率约为18%，1年患病率约为38%［1］。随着我国老年人口的增多和现代生活方式的变化，LBP发病率呈低龄化趋势。椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）是LBP广泛认可的因素之一。导致IDD的原因尚不清楚，但有学者认为，年龄、异常机械应力、创伤、营养缺乏和遗传等因素可能涉及其中［2］。IDD由于代谢失衡，细胞外基质（ECM）成分的变化、髓核细胞的丢失、过度氧化应激和炎症反应导致椎间盘结构恶化，软骨终板内的微孔钙化，使气体和营养物交换遭受损害［3］。目前，保守及手术治疗效果欠佳，不能延缓或逆转其退变进程，因此需要新的治疗方案直接解决IDD的原因，保留或恢复椎间盘结构和机械功能。

由于目前治疗IDD的局限性，越来越多的研究致力于退行性椎间盘再生，主要集中于生物活性分子注射、细胞治疗、组织工程和基因治疗等领域，其中干细胞治疗被广泛关注［4-5］。干细胞分泌的外泌体在再生医学中发挥了重要作用，通过维持内源性干细胞、抑制凋亡和调节免疫反应等方面治疗IDD［6］。外泌体也可以分化为髓核样细胞，并补充机体减少的髓核细胞，延缓IDD进展。本文综述间充质干细胞来源外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos）在IDD治疗方面的研究进展，并为临床工作提供指导。

1 MSC-Exos的生物学特性及功能

随着组织工程和再生医学的发展，外泌体作为细胞间通讯的活性生物物质，其促进组织再生的能力取得了长足进展。MSC-Exos是研究最广泛的外泌体来源之一，其优点是细胞来源丰富，易于得到，亲本细胞来源局限小，生物安全性高［7］。MSC-Exos是一种直径为50～200 nm的膜性扁平状双层纳米级膜状囊泡，源自多泡内核小体，可通过离心、超滤、尺寸排除色谱等方法分离提取［8］。MSC-Exos鉴定的重点是形状、大小和标记蛋白，可通过多种技术实现。MSC-Exos可直接从血浆、精液、尿液等体液获得，并可以有效地运输蛋白和RNA等生物活性物质，在细胞间通讯、信号转导和代谢调节中发挥着重要作用［9］。

MSC-Exos是细胞分泌出的一种小囊泡，包含核酸、蛋白质、脂类等多种成分［10］。其中，脂类对外泌体的稳定性和运输过程中成分的保护起重要作用。MSC-Exos中包含多种蛋白质，这些蛋白质可能参与MSC-Exos的形成和细胞间通讯。此外，MSC-Exos中还含有大量的核酸，包括mRNA、miRNA等，这些核酸可以通过调节靶细胞基因转录影响细胞功能。MSC-Exos作为一种细胞间通讯的信使，能够被靶细胞通过多种方式摄取，从而影响靶细胞的功能，参与多种疾病的发生和发展。

2 MSC-Exos对椎间盘变性的调控机制

MSC-Exos作为促进椎间盘修复的潜在细胞外囊泡，其潜在机制可能是负责维持内源性干细胞，通过促进髓核细胞的增殖和维持ECM稳态，向受损组织输送免疫调节介质，保护细胞免受凋亡、减轻氧化应激和炎症反应等，进而发挥延缓IDD的作用。

2.1 参与ECM的产生与降解 在IDD过程中，ECM的合成代谢紊乱，表现为髓核细胞和纤维内环细胞合成的Ⅱ型胶原蛋白减少，Ⅰ型胶原蛋白合成增加。此外，大量的细胞内炎症因子如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在椎间盘细胞外释放，导致ECM中基质金属蛋白酶（MMPs）与血小板反应蛋白解整合素金属肽酶（ADAMTS）的高表达，这两种酶作为髓核细胞变性的标志蛋白，均能破坏ECM。MSC-Exos在促进椎间盘再生的治疗效果中发挥着重要作用。MSC-Exos可以增强神经元前体细胞（NPCs）中ECM重建表达，抑制MMPs的表达，促进髓核细胞的增殖和维持ECM稳态。LU等［11］发现，MSC-Exos干预后，MMP-1和MMP-3的表达显著降低，导致退变髓核细胞中ECM的表达显著增加。QI等［12］发现，MSC-Exos可以通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化减少ECM降解。IDD与ECM中的硫酸软骨素密切相关，而硫酸软骨素合酶是髓核细胞中ECM合成的关键酶之一。蒋长青等［13］发现，MSC-Exos中富含的miRNA-199/miRNA-16/miRNA-195可与IL/TNF的NF-κB通路结合，减少IL/TNF的合成，促进硫酸软骨素合酶表达，进而促进ECM合成。周荣耀等［14］发现，MSC-Exos可以通过增加基质金属蛋白酶组织抑制因子-1的表达减少ECM的降解。綜上所述，笔者进一步深入研究认为，作为椎间盘的主要成分，MMPs和ADAMTS是降解胶原蛋白和蛋白聚糖的主要酶，它们通过联合作用降低ECM含量并导致IDD。因此，维持ECM的合成/降解平衡对于延缓IDD极为重要，这意味着NPCs中胶原蛋白、蛋白聚糖、MMPs和ADAMTS的表达保持在正常水平至关重要。

2.2 促进抗炎反应 根据研究，炎性小体通过增加IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达，诱导MMPs和ADAMTS的产生，参与IDD的病理过程。而外泌体能显著抑制凋亡NPCs的炎症反应和炎症体的形成，可诱导存活细胞微环境的恢复，减少对细胞内环境的干扰［15］。MSC-Exos可降低H2O2诱导的一氧化氮合酶和IL-6等炎症因子的表达，表明外泌体可减轻炎症反应［16］。MSC-Exos已被证明通过调节NF-κB通路下调炎症反应，通过传递靶向混合系激酶3的miR-142-3p减少IL-1β诱导的炎症细胞因子分泌和MAPK信号通路激活［17］。XIA等［18］研究退行性髓核和正常髓核，发现退行性椎间盘中差异表达的150个蛋白与炎症反应增强密切相关，由此表明，干细胞衍生的外泌体可以通过调控其相关蛋白内容物减轻椎间盘的炎症反应，减少ECM的降解。WANG等［19］研究发现，啮齿类动物脑疝模型中的髓核细胞产生含有miR-223的外泌体，该外泌体已被证明通过调节NF-κB通路下调炎症反应。YUAN等［20］研究发现，MSC-Exos携带AntagomiR-4450，可以治疗小鼠的椎间盘退化。该研究证实，抑制miR-4450可上调锌指蛋白（ZNF121），从而减轻炎症、凋亡和椎间盘细胞损伤。以上研究均表明，外泌体可能通过参与抑制炎症反应进而发挥延缓或逆转IDD的作用。综上所述，笔者认为，炎症作为IDD的标志之一，一直伴随着促炎细胞因子的释放，被认为是导致椎间盘源性疼痛的关键因素。炎症细胞因子的相互作用和异常表达可引起炎症并加速IDD。此外，炎性细胞因子还可以加速细胞衰老、细胞凋亡、激活ECM降解蛋白的表达并抑制ECM结构分子的表达，以增强退化过程。相信随着MSC-Exos的深入研究，MSC-Exos通过参与抑制炎症反应进而发挥延缓或逆转IDD的作用将十分凸显。

2.3 抑制髓核细胞凋亡 IDD主要因为炎症反应、内质网应激等不利因素导致的NPCs凋亡减少进而引起ECM降解。CHENG等［21］的一项研究用人骨髓间充质干细胞和成纤维细胞来源的外泌体治疗TNF-α诱导的凋亡NPCs，骨髓间充质干细胞组细胞凋亡率明显低于其他组。GUO等［22］通过观察内质网应激通路相关分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）及C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）在退变椎间盘内NPCs的表达及其与NPCs凋亡的关系，发现经过MSC-Exos诱导后的NPCs可以明显抑制内质网相关通路和凋亡标志物的表达；表明MSC-Exos可以通过降低内质网应激关键分子CHOP的水平，进而抑制内质网应激介导的细胞凋亡。在大鼠模型中，通过椎间盘内注射MSC-Exos发现，由MSC-Exos衍生而来的miR-21可以抑制磷酸酶和张力素同源物，激活PI3K-AKT通路，从而缓解髓核细胞凋亡和椎间盘变性［23］。ZHU等［24］研究发现，MSC-Exos传输的miR-532-5p可以靶向促进RASSF5基因敲除以减少NPCs凋亡。研究表明，AGEs在髓核组织中积累，可以通过激活UPR诱导内质网应激促进髓核细胞凋亡，而MSC-Exos可以通过激活AKT和ERK信号通路减轻AGEs诱导的内质网应激反应以降低髓核细胞的凋亡率［25］。笔者认为，正常的凋亡可以维持内部环境的稳定性，这是由基因控制的自主程序性细胞死亡，而高凋亡率和衰老导致NPCs减少，意味着过度凋亡可降低椎间盘组织中NPCs的密度，破坏椎间盘的结构和功能，并导致IDD。研究证实，MSC-Exos通过外源性和内源性途径均参与抑制NPCs凋亡过程，因此，减少NPCs凋亡将延缓甚至逆转IDD进程。

2.4 通过miRNA调控椎间盘组织修复 外泌体可以改变椎间盘中许多miRNA的自我表达水平，特别是一些重要的miRNA分子，作为外泌体处理组织损伤和修复的有效调节因子，它们可以参与调节细胞凋亡和炎症反应。当NPCs受到影响时，不仅外泌体自身携带的miRNA可以抑制细胞凋亡，还可以通过外泌体运载特异性miRNA使其成为具有特定效应的载体。ZHANG等［26］研究脂多糖诱导的NPCs凋亡，发现MSC-Exos衍生物miR?410可以直接与NPCs中的炎性小体（NLRP3）mRNA结合，从而降低NLRP3表达，抑制半胱氨酸蛋白酶（Caspase?1）和细胞焦亡蛋白（Gasdermin D）的表达，以发挥明显的抑制NPCs凋亡作用。龚东亮等［27］观察外泌体的形态，比较分析血红素氧合酶-1（HO-1）蛋白在IDD中的表达阳性率，以及miR-21、HO-1和Bach1在大白兔椎间盘组织中的表达，并通过造模处理、分泌物提取、免疫组化染色、Rt-PCR检测、HE染色，及流式细胞术观察大白兔椎间盘组织的形态学变化，观察大白兔退行性髓核细胞的凋亡能力。结果表明，MSC-Exos分泌调节miR-21，抑制Bach1，从而促进HO-1机制修复椎间盘疾病的能力，进而促进退变组织细胞凋亡。徐辰［28］使用高通量检测和生物信息学分析发现，间充质干细胞衍生的外泌体可以显著改善髓核细胞转录后调节因子的表达，这意味着转录后调节因子如miRNA等与外泌体促进IDD中ECM合成密切相关。利用高通量miRNA分析MSC-Exos，结合生物信息学预测技术，发现了一批具有CHSY抑制作用的NF-κB靶向miRNA，并通过适当的实验进行了验证。总之，笔者进一步深入研究认为，MSC-Exos可能通过其所含miRNAs参与调节基因表达和细胞功能，以实现椎间盘的修復和转化，miRNAs的表达谱与髓核细胞的增殖、凋亡、炎症反应，以及ECM重塑等密切相关，这意味着它在调节组织再生方面具有良好的应用前景。

3 MSC-Exos治疗椎间盘的体内研究

大量研究表明，MSC-Exos在体内治疗IDD有效，并取得了不错的结果。XIE等［29］通过叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的氧化应激细胞模型和IDD大鼠模型研究MSC-Exos对终板软骨细胞（EPCs）的作用发现，MSC-Exos可抑制EPCs的细胞凋亡和钙化。ZHOU等［30］研究体内缺氧微环境下MSC-Exos是否对保护IDD表现出更有益的作用；采用尾部IDD大鼠模型研究发现，MSC-Exos

可能通过TLR4途径调节人髓细胞核细胞基质的增殖和合成。笔者认为，MSC-Exos可能通过改善体内和体外合成代谢和分解代谢之间的稳态失衡缓解IDD，为IDD提供了新的治疗靶点。XIA等［18］采用兔IDD模型研究外泌体对IDD的治疗效果，结果表明，MSC-Exos通过抑制炎症介质和NLRP3炎症小体活化，在病理性髓核细胞中起抗炎作用。由此可以推断，NLRP3炎症小体是IDD治疗的有效靶点，注射外泌体可能是一种有前途的治疗策略。LUO等［31］通过体内注射软骨终板干细胞修饰的水凝胶到大鼠软骨终板附近后，软骨终板干细胞衍生的外泌体通过Sphk2/AKT途径平衡自噬和衰老，抑制IDD。笔者认为，本研究为IDD治疗提供了一种新颖有效的非侵入性手术治疗策略，使用可注射的ECM凝胶并持续释放功能性外泌体以延缓IDD进程。总之，这些研究表明，MSC-Exos通过增加ECM的产生，减少NPCs的凋亡，提高相关细胞存活率，平衡细胞自噬和衰老，调节免疫微环境。这些结果证实了体外研究的结果，为IDD提供了一种新的再生治疗方法。

4 小结与展望

椎间盘是体内最大的无血管组织，生理环境复杂，高压、高通透性、低pH、低营养、低氧的微环境不利于髓核细胞的增殖。在退行性椎间盘中，复杂的炎症环境、细胞数量减少和纤维化可能影响体内和体外结果。此外，IDD是一个涉及多种因素的病理过程，其确切机制尚未确定。因此，针对特定原因选择合适的外泌体非常重要。多项研究表明，外泌体参与并减轻IDD的多种病理生理过程，MSC-Exos调节髓核细胞的功能，主要通过细胞间通讯及其内容物的表观遗传修饰，从而使活性髓核细胞数量恢复。此外，外泌体还参与促进ECM合成、抑制ECM降解及细胞凋亡、抗炎反应等作用。同时，外泌体应用于IDD治疗仍存在许多问题，例如，外泌体提取分离、靶向转移、药物剂量、疗效评价，以及其相关产品的细胞源、类型、制备工艺等方面差异较大，而治疗机制和体内活性等相较传统药物更加复杂。因此，需要进一步深入研究外泌体的复杂调控机制，优化培养和移植条件，并进行更多的临床前试验验证外泌体的安全性。随着对椎间盘及外泌体研究的深入，相信IDD治疗中外泌体的研究应用前景会进一步扩大。

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收稿日期：2023-01-27；修回日期：2023-03-08