不同浓度大豆卵磷脂替代蛋黄对东佛里生奶绵羊精液冷冻保存效果的影响

赵 霞,爱伦高娃,马跃军,樊 东,乌仁图亚,娜仁花,吉林台,*

(1.内蒙古自治区农牧业科学院,内蒙古 呼和浩特 010031;2.内蒙古医科大学附属医院;3.赤峰市巴林左旗畜牧工作站;4.内蒙古农业大学)

提高精液冷冻保存效果是实现高质量发展人工授精技术的关键环节,也是建立现代畜牧业遗传资源库的重要策略之一。选取优质冻精资源进行人工授精不仅可以从源头上减少生殖疾病的传播,还可以提高优秀种质资源的改良速度,增加对遗传特性和生产性能的高效选择。目前,因绵羊精子易受低温环境的影响发生冷休克现象,我国绵羊精液的冷冻保存技术尚未取得实质性的进展;羊精液的冷冻保存过程中,温度和渗透压的改变会严重降低精子活力,产生精子膜功能受损、脂质过氧化和冷冻保护剂的毒害等现象,降低精子与卵母细胞的结合能力,因此,优化冷冻精液生产工艺对于绵羊精液的长期高效保存具有重要意义。

蛋黄作为冷冻保护剂广泛用于精液的冷冻保存,可以稳定精子顶体膜并在解冻时降低耗氧量。但是,配制冷冻稀释液时,蛋黄质量难以控制,存在病毒感染源和过敏原的风险,并且蛋黄中特殊成分能与精清中酶类物质相互作用,所产生的物质对精子具有毒害作用。通常在稀释前通过去除部分精清,降低蛋黄的毒害作用,从而提高解冻后的精子质量。此外,蛋黄内微生物所释放的内毒素会降低精子的受精潜力。

因此,蛋黄作为冷冻保护剂具有潜在的风险,从生物安全方面考虑,选择不含动物源性的冷冻保护剂十分必要。相关研究表明,大豆卵磷脂(Soybean lecithin,SL)可以替代动物源性冷冻保护剂保存人类、牛和山羊的精液。但截至目前,未见SL在东佛里生奶绵羊精液冷冻保存中使用的报道。本研究旨在评价不同浓度SL在奶绵羊精液冷冻保存中的效果,以添加蛋黄的冷冻精液稀释液作为对照组,评价不同处理组对精子活率、顶体完整率和妊娠率的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物和精液采集 本研究选用来自同一饲养管理条件下的5只优秀东佛里生奶种公羊;实验前40 d,对每只种公羊的日粮添加胡萝卜和鸡蛋,并自由取水;保持每天3～5 km早晚各一次的定时定量运动并使用假阴道法从公羊体内收集精液。

1.1.2 试验药品 Tris( 三羟甲基氨基甲烷)、果糖、柠檬酸、甘油和大豆卵磷脂(SL)购自Sigma-Aldrich (USA)公司;伊红、青霉素、链霉素购自国内。

1.1.3 仪器设备 电子天平(日本)、生物相差显微镜(尼康)、全自动精子分析仪(美国HamiltonThome lvos ll)、0.25 mL麦管(法国)、封口粉(日本);血细胞计、超声波细胞粉碎仪、pH测试仪、恒温版、恒温水浴锅、细管架、冰箱、剪刀和自制泡沫冷冻箱,以上设备均来自国内。

1.2 试验方法

1.2.1 稀释液的配制 Tris基础稀释液的配置:所需化学药品Tris、果糖、柠檬酸用万分之一分析天平精准称量(表1),放入100 mL的烧杯内,加入50 mL双蒸水后用玻璃棒进行搅匀,定容至100 mL后倒入三角瓶封口高压灭菌;冷却后分别加入青霉素、链霉素配制成pH为6.8的基础稀释液。

表1 Tris基础稀释液配方

Ⅰ号稀释液的配制(对照组):在Tris基础液中分别加入18%蛋黄和7%灭菌的甘油,用超声波仪进行加速溶解和离心,使用细菌过滤器过滤后备用。

Ⅱ-Ⅵ稀释液的配制(试验组):在Tris基础稀释液中分别加入不同浓度的大豆卵磷脂(0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%)和7%灭菌的甘油(表2),用超声波仪进行加速溶解和离心,使用细菌过滤器过滤后备用。

表2 不同添加剂稀释液的配方 %

1.2.2 精液采集和质量检测 使用假阴道法采集精液后,立即将精液放置于34℃恒温水浴锅中的试管,静置10～15 min后观察精液颜色,检测精子活率、精子密度和射精量。选择射精量在0.5～2 mL、精子浓度为1.5～2×109精子/ mL、精子活率大于85%、异常精子率小于10%的精液备用。

1.2.3 精液冷冻处理 为消除个体间差异,将采集的不同公羊的精液混合,分成六等份,分别用Ⅰ-VI号稀释液进行等温稀释,稀释至最终浓度为4.0×107个精子/ mL,并置于37℃水浴锅中平衡10 min,平衡后的精液装入0.25 mL麦管中,并用聚乙烯醇密封。将所有麦管用纯棉毛巾或纱布包裹放入4℃冰箱中平衡3 h,再将麦管放置在距离液氮表面3 cm处熏蒸10～12 min,然后收集麦管投入液氮中保存备用。

1.2.4 冻精细管解冻后的质量评定 冻精细管在37℃水浴锅中解冻30s,依照常规方法检测解冻后的精子活率、存活时间、死精子率和顶体完整率。根据Mortimer标准,精子颈部区域呈现轻微粉红色或红色的归类为活精子。

1.2.5 腹腔镜输精 腹腔镜输精技术与同期发情技术相结合进行输精。上述方法冷冻的精液解冻后借助腹腔内窥镜,采用套管针穿刺方法,将精液直接输入到发情后30～36 h母羊的(术前空腹12 h以上)子宫角,做到“精准输精”。

1.2.6 母羊管理及妊娠诊断 输精后的母羊每天补饲优质干草、青干草、青贮饲料,妊娠后期适量补充精料、微量元素等。输精后35～40 d使用羊用B超仪检测妊娠情况,统计妊娠母羊数。

1.3 统计分析

采用SPSS统计软件对随机区组设计得到的试验数据进行单因素方差分析(ANOVA),进一步用Etukey-Kramer检验评估统计学上的差异,当P<0.05时,差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同冷冻稀释液对精子活率、顶体完整率的影响

精液分别用冷冻稀释液Ⅰ(对照组)和冷冻稀释液Ⅱ-Ⅵ(试验组)稀释,在4℃冰箱中降温平衡3 h,用液氮熏蒸冷冻后投入液氮中保存。解冻后检查其活率和顶体完整率,结果见表3。

表3 不同稀释液对精子活率、顶体完整率的影响 %

表3显示,0.5%、2.5%SL组精子解冻后活率和顶体完整率低于其他组(P<0.05);18%蛋黄和1%、1.5%、2%SL组精子解冻后活率和顶体完整率显著高于其他各组,且显著高于0.5%和2.5%组(P<0.05)。

2.2 不同稀释液对冷冻精液受胎率的影响

表4显示,添加18%蛋黄和1.0%～1.5%SL冷冻稀释液稀释的精液,人工授精后母羊的妊娠率之间无显著差异(P>0.05)。

表4 不同稀释液对冷冻精液受胎率的影响 只,%

3 讨论

在大多数动物精液冷冻过程中,蛋黄作为高效的冷冻保护剂而广泛应用。但是,禽类的蛋黄作为精液冷冻保护剂容易受到病原体和细菌的污染,并有可能导致疾病的传播,而面临卫生安全问题,直接影响精液品质。此外,因蛋源不同或蛋源不明会导致无法控制其质量。因此,世界各地实验室在不断研究可以替代动物源性蛋黄的新型精液冷冻保护剂。而大豆卵磷脂是一种植物源性冷冻保护剂,是高分子量脂蛋白和磷脂的替代品,即可降低动物源性冷冻保护剂的卫生风险,又能防止稀释、冷却和超低温保存过程中对精子质膜的损伤。研究表明,SL用于冷冻牛精液、公羊精液和山羊精液效果显著。所以,精液冷冻保存过程中,使用非动物源性的冷冻保护剂代替蛋黄是提高羊冷冻精液安全生产效率和冷冻精液受精率的关键所在。

Waterhouse等研究报道表示,大豆卵磷脂在冷冻过程中的保护作用是通过磷脂在降低至冰点过程中减少冰晶的形成而实现。磷脂是蛋黄和大豆卵磷脂磷酸盐的主要成分,外源磷脂可以取代精子质膜的磷脂,维持精子质膜结构和功能的正常运行。因此在精子冷冻过程中,这种植物性磷脂能够有效降低精子质膜的氧化受损。本研究结果显示,在奶绵羊精液冷冻保存液中添加浓度为1%～2%的大豆卵磷脂,能使精子解冻后的活率、顶体完整率和妊娠率均与蛋黄作为保护剂所得效果无显著差异,表明SL在奶绵羊精液冷冻过程中对精子起到了保护作用。

另外,本试验在添加1% 、1.5%SL稀释液稀释奶绵羊精液时发现,SL对精子的运动速度有明显的促进作用,这可能与蛋黄稀释液黏度高于SL稀释液有关,高黏度环境会阻碍精子的运动速度。但是,高浓度的SL对精子活力和存活能力有一定的毒性作用。稀释液中加入高浓度的SL会增加稀释液的黏度,而稀释液中的杂物也会降低精子的受精能力,这可能与稀释液的渗透压有关。稀释液中渗透压随着SL浓度的增加而降低,导致精子发生损伤现象。

由于较高浓度的SL可能存在对精子的毒害作用,而较低浓度可能不足以保护精子,所以稀释液中的大豆卵磷脂含量存在一个临界值。这与本试验结果相一致,当SL添加浓度为1%～2%时,公羊精液解冻后精子活率和顶体完整率较高,而SL添加浓度为0.5%和2.5%时,精子活率和顶体完整率下降。所以,在东佛里生奶绵羊精液冷冻保存稀释液中大豆卵磷脂最佳浓度为1%～2%。且Khalifa等报道,添加大豆卵磷脂的冷冻精液在输精后获得了较理想的受胎率,与蛋黄冻精受胎率无显著差异。

综上所述,大豆卵磷脂可以取代蛋黄作为精液冷冻保护剂,并在精液冷冻-解冻过程中对精子发挥保护作用,其最佳添加浓度为1%～2%。这为商业化、标准化地生产绵羊冷冻精液奠定基础,提高绵羊冻精的冷冻效果,促进羊冻精供种的进程。