酶联免疫吸附试验检测狂犬病抗体的实际应用探讨

李 繁,吴寒光, 段新华, 施远国, 罗国强, 陈雨晴, 李颖鑫

(深圳市动物疫病预防控制中心, 广东 深圳 518052)

狂犬病是由弹状病毒科的狂犬病毒(Rabies virus, RV)引起的人畜共患传染病,主要在野生动物(狼、狐狸、鼬鼠、蝙蝠等)及家养动物(狗、猫、牛等)中流行传播。人狂犬病主要被患病动物咬伤所致,或与密切接触有关,感染发病后进展速度快,病死率高达100%。动物接种狂犬病疫苗是预防人狂犬病最有效的手段,因此加强犬、猫的狂犬病免疫工作具有十分重要的公共卫生意义。

动物接种疫苗后,科学评价免疫效果有赖于准确检测和监测血清中狂犬病免疫抗体水平,现有的检测方法有多种,如荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)、小鼠病毒中和试验(MNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等,前三种方法特异性强、准确性好,但都需要活病毒,试验时间长,对实验室生物安全条件和仪器设备配置要求高,不适合在基层检测中推广应用。而ELISA检测操作简便快捷,成本也不高,近年来已有商品化的试剂盒应用于狂犬病免疫抗体的监测,以评估免疫效果。本研究以FAVN法为标准,对ELISA检测的符合率、特异性、灵敏度、假阳性、假阴性、OD值区间分布等参数进行全面分析,探讨ELISA方法的应用价值,为基层检测业务的开展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂盒 狂犬病毒抗体ELISA检测试剂盒,批号:RV20211008E,由国内某生物药业有限公司生产。

1.1.2 仪器 洗板机:BIOTEX ELX808,酶标仪:BIOTEX ELX50,精密移液器:Eppendorf。

1.1.3 检测样品 犬血清。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 犬只来自深圳市10个行政区,随机采样,无菌采血3mL,凝固后分离血清于离心管中,一式两份,-20℃保存待检。

1.2.2 中和试验 委托军事医学科学院军事兽医研究所OIE狂犬病参考实验室检测,检测方法为荧光抗体病毒中和试验(FAVN)。中和效价≥0.5 IU/mL,判样品阳性,表示该份血清的来源动物具备狂犬病免疫保护能力,中和效价<0.5 IU/mL,判样品阴性,表示该份血清的来源动物无狂犬病免疫保护能力。

1.2.3 ELISA检测 严格按试剂盒使用说明书进行样品稀释、加样、孵育、洗板、显色、终止反应、读板等操作。以酶标仪双波长450nm和630nm读取OD值,并计算A值和S/CO值:A值=OD450nm- OD630nm,S/CO值=样品A值/临界对照A值。当S/CO值≥1.0,判样品阳性;S/CO值<1.0,判样品阴性。

1.2.4 数据分析处理 采用SPSS软件对检测结果分析处理,进行一致性检验,计算Kappa值,评估ELISA与FAVN的检测结果一致性,并对阳性符合率、阴性符合率、总符合率、特异性、灵敏度、OD值与抗体水平的关联性和分布等进行计算分析。

2 结果与数据统计

2.1 样品定性检测结果

结果见表1,共检测了来自深圳市10个行政区的290份犬血清,FAVN法检测为阳性样品260份、阴性样品30份,ELISA法检测为阳性样品228份、阴性样品62份。

上表数据,经采用SPSS软件进行诊断结果一致性检验,Kappa值为0.545。

260份FAVN法阳性样品中,ELISA法检测为226份阳性,阳性符合率为86.92%;30份FAVN法阴性样品中,ELISA法检测为28份阴性,阴性符合率为93.33%;总符合率为87.59%(254/290)

2.2 不同中和效价的样品检测结果

FAVN法中和效价≥0.5 IU/mL,判样品阳性,中和效价<0.5 IU/mL,判样品阴性。将阴性样品分类设2个中和效价区间,阳性样品设10个中和效价区间,分别对ELISA法检测结果的符合率进行了分区间计算,结果见表2和图1。符合率最高为100%,最低为55.88%。

图1 不同中和效价的样品ELISA法检测结果符合率

表2 不同中和效价的样品ELISA法检测结果

2.3 相同中和效价的样品检测结果

选取表2中ELISA法与FAVN法检测结果一致的样品,分析同一中和效价的不同样品的OD值大小分布区间。考虑统计数量的要求,选择了同一中和效价的样品数量≥20份者,其中4.5 IU/mL样品34份,13.5 IU/mL样品55份,40.5 IU/mL样品55份。以上144份样品OD值经计算S/CO值最高为7.3。S/CO值分区间统计结果见表3和图2～图4。

图3 中和效价13.5IU/mL的样品ELISA检测S/CO值分布图

图4 中和效价40.5IU/mL的样品ELISA检测S/CO值分布图

表3 相同中和效价的样品ELISA检测S/CO值区间分布

表3数据和图2～图4分布图显示,中和效价4.5 IU/mL和13.5 IU/mL的样品无S/CO值≥6.0的检测值,其它各S/CO值区间均有分布。中和效价4.5 IU/mL的样品S/CO值在1.0～1.9区间的百分率最高(47.06%),中和效价13.5 IU/mL的样品S/CO值在4.0～4.9区间的百分率最高(30.91%);中和效价40.5 IU/mL的样品S/CO值在2.0～2.9区间的百分率最高(27.27%),4.0～4.9区间的百分率为25.45%。

3 讨论

3.1 免疫保护屏障

当犬群免疫覆盖率达到70%以上时,即可有效抑制狂犬病的传播 。荧光抗体病毒中和试验(FAVN)是国际兽医局(OIE)推荐用于检测动物血清狂犬病抗体活性的方法。本次研究检测样品来自深圳10个行政区,FAVN法检测免疫保护合格率达89.66%;经初步分析犬只免疫史,发现成年和经多次免疫的犬血清中和效价水平都较高,而幼年犬、仅初免或未按要求加强免疫的,则中和效价水平较低或不合格。深圳市2006年颁布《深圳市养犬管理条例》,实行狂犬病免费强制免疫制度,市政府将每年的4月和9月定为犬类狂犬病强制免疫行动月,不断提高免疫率,并将狂犬病疫苗经费纳入财政预算,统一采购进口狂犬病灭活疫苗,以提高免疫质量。经多年的免疫效果监测发现,深圳市的犬类狂犬病免疫抗体合格率一直保持在较高水平,建立了良好的免疫保护屏障。

3.2 定性检测

Kappa检验常用于评价待验证的诊断实验方法与金标准的一致性,Kappa取值0～1之间,Kappa≥0.75,说明两种方法诊断结果一致性较好; 0.4≤Kappa<0.75,说明两种方法诊断结果一致性一般; Kappa<0.4,说明两种方法诊断结果一致性较差。本研究数据经采用SPSS软件对FAVN法和ELISA方法进行诊断结果一致性检验,Kappa值为0.545,表明该ELISA检测试剂盒的结果为中度一致。王培等曾比较6种国产和进口的不同品牌的商品化试剂盒,Kappa值由高至低依次为:0.583、0.549、0.465、0.370、0.184、0.105,前两种均为进口试剂盒,本次试验所用试剂盒Kappa值为0.545,说明检测效能与进口产品相近。

阳性符合率通常用于评估检测的灵敏度,而阴性符合率是检测特异性的重要指标,本次试验所用ELISA试剂盒的阳性符合率为86.92%;阴性符合率为93.33%;总符合率为87.59%。说明特异性强,出现假阳性的概率较小,相比较则阳性符合率略低,说明产品的灵敏度有待提高,检测时出现假阴性的概率会大于出现假阳性的概率,在基层应用ELISA法检测时,对检测结果分析时应予注意。

从不同中和效价的样品检测结果可以看出,中和效价0.00～0.20 IU/mL和中和效价≥15.01的样品符合率均为100%,说明这些中和效价区间的样品ELISA法检测时不会出现假阳性和假阴性。符合率最低的为中和效价0.51～ 2.00 IU/mL的样品,符合率仅为55.88%;其次为中和效价0.5 IU/mL的样品,符合率为62.5%;说明这两个中和效价区间的样品,ELISA法检测时容易出现假阴性的结果。随着中和抗体效价的升高,符合率也逐步提高,这提示在作免疫效果评价时,若为初次免疫,且接种后时间不长的犬只,建议对ELISA法检测的阴性结果进一步进行验证。

动物免疫应答产生的抗体水平为包含中和抗体在内的所有抗体的总和,其特异性结合位点既有狂犬病毒颗粒内部的结构蛋白或酶,也有病毒外部蛋白表位如糖蛋白等, 因此血清抗体水平始终不能代表保护性中和抗体的水平,这也是ELISA法与FAVN法检测结果有差异的根本原因。不同品牌厂家的产品,由于生产工艺和技术不同,其酶标板上包被不同的抗原或者不同的单抗或多抗,纯度也有差异,此外疫苗种类和来源不同,其免疫应答抗体的组成和水平也会有差异,因此ELISA法检测结果的可靠性受多种因素的影响,建议各地应通过采集当地犬只血清进行试剂盒比对试验,选择特异性强、灵敏度高、稳定性好的产品用于免疫抗体水平监测的初步筛查。

3.3 定量检测

本次试验中和效价4.5 IU/mL和13.5 IU/mL的样品无S/CO值≥6.0的检测值,47.06%中和效价4.5 IU/mL的样品其S/CO值区间为1.0～1.9;而中和效价为40.5 IU/mL的样品则有9%的检测值为S/CO值≥6.0。但更需要注意的是,在ELISA法检测S/CO值(1.0～5.9)由低至高的各个区间中,相同区间内各个中和效价的阳性样品均有分布,也就是说中和效价与S/CO值两者之间并不存在一一对应的线性关系,高中和效价的样品其S/CO值可能也会小于低中和效价的样品,反之,低中和效价的样品其S/CO值可能也会高于高中和效价的样品。因此利用ELISA法作为检测狂犬病免疫保护抗体水平的定量检测方法,其有效性难以确认。

于鹏程等通过检测60份免疫后的人血清,认为ELISA法可用于定量检测0.5～10 IU/mL的有效线性范围的血清样本,与本次研究的结果有异,可能与所用试剂盒不同有关,而且人和动物的血清样本、以及免疫疫苗和抗体结构等均有差异。袁洁等在对广州地区家养犬只开展免疫抗体水平监测中也发现ELISA在测定具体的抗体滴度方面与FAVN仍有较大误差。我们认为,在检测动物血清样本时,与FAVN法的金标准比较,ELISA方法的定性效能尚存在诸多差异,若用于定量检测,需要做更广泛深入的研究。