白鲜皮及汉黄芩素治疗银屑病的网络药理学研究及细胞验证

林丽云， 林钰， 雷海青， 刘靖， 张粤琳， 黄伟乐， 杨丽红， 陶佳豪

（1.广州中医药大学，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院皮肤科，广东广州 510405）

银屑病是一种免疫相关性慢性炎性皮肤疾病，我国发病率约0.47%[1]。现已有激素、免疫抑制剂、生物制剂、光疗等手段可明显改善寻常型银屑病皮损，但可观的疗效同时伴有许多潜在的危险因素，例如肿瘤发生风险的增加，还有在安全性、有效性、价格、使用期限等方面上仍存在的诸多限制。中药因疗效可靠、毒副作用小具有独特的优势。白鲜皮，为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpusTurcz.的干燥根皮，为皮肤科常用药，始载于《药性论》，言其“治一切热毒风，恶风，风疮、疥癣赤烂，眉发脱脆，皮肌急，壮热恶寒”，具有清热解毒、祛风燥湿的功效，主要应用于湿疹、银屑病等瘙痒性疾病的临床治疗。白鲜皮亦是银屑1号方的重要组成，银屑1号方已从临床、动物实验、细胞实验证实能确切治疗银屑病[2-4]。但白鲜皮治疗银屑病的具体作用机制尚不明确。因此，本研究从白鲜皮治疗银屑病的网络药理学分析出发，并采用细胞实验验证法，探讨白鲜皮治疗银屑病靶点和机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 网络药理学研究

1.1.1 检索白鲜皮化学成分 本研究以“白鲜皮”为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台[5]（TCMSP，version 2.3）（https://tcmsp-e.com/index.php）搜索白鲜皮化学成分，并与中医百科全书数据库[6]相验证，进行化学成分的补充。

1.1.2 明确白鲜皮主要活性成分及作用靶点 口服生物利用度（OB）和类药性（DL）是评估体外药代动力学的主要指标。OB 代表进入人体循环中的化学成分在中药总体成分中的比例，反映该化学成分吸收度，OB ≥30%被作为潜在药物成分阈值[7]。DL 则代表着化学成分与现有已知药物的结构相似度，反映该成分成为潜在有效药物成分的可能性，由于DrugBank数据库中已知的6 511个分子的平均DL值为0.18，故DL ≥0.18被作为潜在药物成分阈值[7-8]。在TCMSP数据库以及现有文献研究[9]中，均推荐使用OB ≥30%及DL ≥0.18 作为中药主要活性成分的筛选条件。在筛选出主要活性成分后可在TCMSP数据库中同时明确其作用靶点基因。

1.1.3 检索银屑病治疗靶点 GeneCards 是一个大型在线可交互式数据库，涵盖人类基因数据库、疾病数据库等，可以通过输入疾病名称而分析该疾病的潜在治疗靶点。本研究以“psoriasis”为关键词进行检索，在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/，version 5.12.0）中得到银屑病的潜在治疗靶点。

1.1.4 白鲜皮治疗银屑病潜在靶点分析及构建蛋白互作网络 使用Jvenn工具分析白鲜皮主要成分作用靶点与银屑病治疗靶点之间的交集[10]，作为白鲜皮治疗银屑病的潜在靶点。在既往研究数据的基础上，应用STRING 数据库[11]（version 11.0）对输入基因的相互关系进行整理和预测，构建包含所有潜在治疗靶点的复杂网络。然后通过Cytoscape 软件[12]（version 3.7.2）对这部分数据进行可视化呈现，构建蛋白互作网络。

1.1.5 潜在治疗靶点富集分析与关键基因筛选 京都基因和基因组百科全书（KEGG）是一个可以对基因功能和用途进行通路富集的数据库[13]。基因本体论（GO）是一个旨在了解和描述不同物种的基因和蛋白质如何工作的数据库[14]。使用DAVID[15]（version 2022q2）数据库进行这2项生物信息学富集分析。为进一步提升数据可信度，将P＜0.01 及FDR＜0.01 设置为筛选条件，通路与信息选择前10、15 条并进行可视化呈现。CytoHubba[16]是Cytoscape的一个插件，用于分析现有复杂网络的关键节点和子集。采用度值（Degree）算法对蛋白互作网络进行筛选，并选择其中排前10 位的靶点进行进一步分析，即得白鲜皮治疗银屑病的关键靶点。

1.2 细胞验证

1.2.1 药物、试剂与仪器 汉黄芩素（wogonin），购自成都瑞芬思生物科技有限公司（CAS：632-85-9）。DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，美国Gibco 公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，日本同仁公司）；TRIzol（美国Invitrogen公司）；Evo M-MLV 反转录试剂预混液（广州瑞真生物技术有限公司）；SYBR Green Pro Taq HS 预混型qPCR试剂盒（广州瑞真生物技术有限公司）。全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；ABI 2720型PCR扩增仪（美国Applied Biosystems 公司）；ABI 7500 型荧光定量PCR 仪器（美国Applied Biosystems 公司）。

1.2.2 构建银屑病样细胞模型 人类永生化角质形成细胞株（HaCaT cell line），购于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心。细胞完全培养液配方为90%DMEM 高糖培养基+10%FBS。细胞培养在37 ℃、含5%CO2无菌细胞培养箱中。在6 孔板中以1 μg/mL 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）分别处理细胞0、2、4、8、12、24 h后，采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）法检测炎性因子水平，选择上升最为明显的时间作为后续实验条件。

1.2.3 检测汉黄芩素干预HaCat 细胞的半抑制率浓度（IC50） IC50即达到50%抑制效果时抑制剂的浓度。取对数生长期细胞重悬浮后，计数并将细胞悬液稀释成为1.5×104个/mL，在96孔板中每孔沿边缘注入200 μL细胞悬液，密度约为3 000个。在24 h 细胞贴壁后进行干预处理，设置空白组（完全培养基），对照组（完全培养基+细胞），实验组（完全培养基+细胞+不同浓度梯度汉黄芩素），每组至少设置3个复孔。根据查阅的相关文献，汉黄芩素浓度分别设置为1、10、40、100、160、320、480、960、1 280 μmol/L。在细胞种板区域周围一圈孔内使用磷酸盐缓冲液（PBS）填充以避免“边缘效应”。培养24 h后，弃去旧培养基，每孔加入110 μL CCK-8 工作液（100 μL DMEM+10 μL CCK-8），避光环境中反应3 h后，于酶标仪中读取在450 nm波长处的吸光度值。细胞抑制率=[（对照组吸光度值-实验组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）]×100%。使用SPSS 23.0软件计算IC50。

1.2.4 qPCR 法分析汉黄芩素对关键靶点的干预作用 使用TRIzol 法提取细胞RNA，以OD260/280＞2.0，OD260/230＞2.0作为核酸质控标准。按照RNA逆转录说明书执行，将逆转录预混液、核酸样品在八连管中进行混合，使用离心机将混合液沉淀到管底后，使用逆转录仪器进行逆转录，反应条件如下：①37 ℃15 min；②85 ℃5 s；③4 ℃维持。逆转录产物为cDNA，稀释2倍后进行qPCR反应。将cDNA、PCR预混液、引物混合后离心，于96孔板种板，每组设置3 个复孔，内参选择GAPDH。反应条件如下：第一步，95 ℃30 s 1 个循环；第二步：95 ℃5 s 转60 ℃30 s 进行40 个循环；第三步，进入溶解曲线阶段。反应结束后，采用2-△△CT（Livak）方法计算目的基因mRNA 相对表达量。GAPDH 上游引物序列为5’-ACAGTCCATGCCATC ACTG-3’，下游引物序列为5’-AGTAGAGGCAGG GATGATG-3’；TNF-α 上游引物序列为5’-GAGG CCAAGCCCTGGTATG-3’，下游引物序列为5’-C GGGCCGATTGATCTCAGC-3’；TP53 上游引物序列为5’-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3’，下游引物序列为5’-TCATCCAAATACTCCACACGC-3’；IL-6 上游引物序列为5’-ACTCACCTCTTCAGAAC GAATTG-3’，下游引物序列为5’-CCATCTTTGG AAGGTTCAGGTTG-3’；ESR1上游引物序列为5’-CCCACTCAACAGCGTGTCTC-3’，下游引物序列为5’-CGTCGATTATCTGAATTTGGCCT-3’；PTGS2 上游引物序列为5’-CTGGCGCTCAGCCATACAG-3’，下游引物序列为5’-CGCACTTATACTGGTCAAAT CCC-3’；HSP90AA1 上游引物序列为5’-CATAAC GATGATGAGCAGTACGC-3’，下游引物序列为5’-GACCCATAGGTTCACCTGTGT-3’；PPARG 上游引物序列为5’-GGGATCAGCTCCGTGGATCT-3’，下游引物序列为5’-TGCACTTTGGTACTCTTG AAGTT-3’；NF-κB 上游引物序列为5’-AACAGA GAGGATTTCGTTTCCG-3’；下游引物序列为5’-T TTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’。

1.2.5 统计方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较，数据满足正态性分布与方差齐性，采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白鲜皮主要活性成分及作用靶点通过在TCMSP 数据库检索白鲜皮化学成分，并与中医百科全书数据库相互验证，经去重后共筛选出64 种白鲜皮成分。以OB ≥30%及DL ≥0.18 作为中药主要活性成分的筛选条件，共筛选出18 种有效单体成分，其中7 种无对应靶点成分，最后选择11 种作为后续研究对象（见表1）。这11 种有效化合成分共计对应328个靶点，经过去重，最后得到106个有效对应靶点。

表1 白鲜皮主要有效成分Table1 The main active components of Dictamni Cortex

2.2 构建白鲜皮-主要活性成分-银屑病调控靶点图使用GeneCards 数据库分析银屑病调控靶点，发现共有4 055个可供调控的靶点，经与白鲜皮主要活性成分调控靶点取交集后，其中63 个可能是白鲜皮治疗银屑病的潜在调控靶点（见图1）。将这63个靶点导入STRING数据库建立蛋白互作关系网络，导出后应用Cytoscape软件建立了白鲜皮-主要活性成分-银屑病调控靶点图（见图2）。

图1 银屑病疾病靶点与白鲜皮有效成分对应靶点的交集Figure 1 Intersection of psoriasis disease targets with the corresponding targets of the active components of Dictamni Cortex

图2 “白鲜皮-主要活性成分-靶点”蛋白互作图Figure 2 Protein interaction map of“Dictamni Cortexcomponents-targets”

2.3 对治疗靶点的进一步分析使用DAVID数据库进行KEGG 通路富集与GO 富集。对GO 功能富集结果中排序前5 条进行了展示：分子功能（molecular function，MF）显示主要富集于前列腺素-内过氧化物合酶活性、一氧化氮合酶活性、DNA 结合域结合、四氢生物喋呤结合和超氧化物歧化酶活性；细胞组成（cellular component，CC）显示主要集中于分选内体、树突细胞质、小窝、质膜筏、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物；生物过程（biological process，BP）显示主要富集于钙二醇1-单加氧酶活性的正向调节、白细胞与动脉内皮细胞黏附的正调控作用、铁对翻译引发的正向调控、对硫化氢的反应以及TAU 蛋白激酶活性负调控。见图3。KEGG 通路富集结果显示，63 个潜在治疗靶点主要富集于膀胱癌、非洲锥虫病、疟疾、IL-17信号通路和移植物抗宿主病通路，见图4，提示白鲜皮主要有效成分调控银屑病主要通过免疫与炎症相关通路。

图3 63个重合基因GO分析Figure 3 GO analysis of 63 overlapping genes

图4 63个重合基因KEGG分析Figure 4 KEGG analysis of 63 overlapping genes

2.4 对白鲜皮主要活性成分的进一步挖掘使用Cytoscape 中CytoHubba 插件对63 个潜在治疗靶点中度值（Degree）排前10 位的复合物进行挖掘，得到的10 个基因即为白鲜皮主要有效成分调节银屑病的关键靶点，见图5。在对这10个基因所对应的调控有效化合物回溯上，研究发现，槲皮素、木犀草素、汉黄芩素所能调控的靶点较多，见表2。在文献研究基础上，发现既往已经存在槲皮素及木犀草素治疗银屑病的体外研究及体内研究，但缺少关于汉黄芩素治疗银屑病的相关研究，故后续研究选择汉黄芩素为对象，PPARG、ESR1、HSP90AA1、IL-6、PTGS2、TNF-α、TP53、NF-κB作为后续研究靶点。

图5 对63个重合基因使用CytoHubba插件筛选出排前10位的关键基因Figure 5 Screen of top 10 key genes using CytoHubba plugin for 63 overlapping genes

表2 白鲜皮主要有效成分对应关键基因Table 2 The main active components of Dictamni Cortex corresponding to key genes

2.5 构建银屑病样细胞模型HaCaT 细胞是银屑病细胞实验常用的细胞类型，其接受特定的刺激后，产生银屑病标志性炎症因子来介导炎症反应的发生[17-18]。文献研究[19]中也提到采用LPS 刺激HaCaT细胞可以构建银屑病样细胞模型。本研究以1 μg/mL LPS处理HaCaT细胞0、2、4、8、12、24 h后收集细胞样本，提取RNA进行qPCR检测，结果发现，在LPS 干预细胞4 h 后， TNF-α、IL-6、NF-κB mRNA表达水平上升（均P＜0.005）。见图6。表明银屑病样细胞被成功构建，可作为实验对象。

图6 脂多糖（LPS）干预HaCaT细胞不同时间后TNF-α、IL-6、NF-κB mRNA表达情况Figure 6 The mRNA expressions of TNF-α，IL-6 and NF-κB after different times of LPS intervention in HaCaT cells

2.6 汉黄芩素干预潜在治疗靶点的研究本研究用不同浓度汉黄芩素干预HaCaT细胞24 h后，计算得到汉黄芩素对HaCaT 细胞的IC50为415 μmol/L。见图7。选取10% IC50近似值作为实验浓度，即40 μmol/L。使用40 μmol/L汉黄芩素干预HaCaT细胞24 h，在第20 小时加入LPS 进行诱导。在汉黄芩素干预第24小时，即LPS诱导第4小时，收集细胞，提取RNA进行qPCR检测，结果发现，汉黄芩素可以提高LPS 诱导HaCaT 细胞模型PPARG mRNA 表达，降低ESR1、HSP90AA1、IL-6、NF-κB、PTGS2、TNF-α、TP53 mRNA 表达（P＜0.05或P＜0.005）。见图8。

图7 不同浓度汉黄芩素的HaCaT细胞抑制率Figure 7 Inhibition rate of HaCaT cells by different concentrations of baicalin

图8 10%IC50汉黄芩素对HaCaT细胞银屑病样模型ESR1、HSP90AA1、IL-6、NF-κB、PTGS2、TNF-α、TP53、PPARG mRNA表达的影响Figure 8 Effect of 10%IC50 Wogonin on mRNA expressions of ESR1，HSP90AA1，IL-6，NF-κB，PTGS2，TNF-α，TP53，PPARG in HaCaT cell psoriasis-like model

3 讨论

本研究运用网络药理学探讨白鲜皮治疗银屑病的作用机制，建立“白鲜皮-主要活性成分-靶点”网络图，发现白鲜皮的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、汉黄芩素等。槲皮素是一种黄酮类化合物，广泛存在于银杏、贯叶连翘、鱼腥草等天然植物中，具有多种生物学特性，包括抗炎、抗氧化、心脏保护、血管扩张、肝脏保护和抗癌活性等[20-21]。研究[23]表明，槲皮素的抗炎活性依赖于调节多种不同信号通路，包括MAPK 信号通路、NF-κB 通路[22]和Nrf-2 通路。槲皮素治疗银屑病的主要机制可能与改善抗氧化和抗炎状态，抑制非典型的NF-κB 信号通路的激活密切相关[24]。木犀草素是一种存在于多种药用植物中的黄酮类化合物[25]，具有抗氧化、抗微生物、抗炎、化学预防、心脏保护、抗糖尿病、神经保护和抗过敏特性，如白菊、香蒲等都含有很高的木犀草素含量，已被开发出用于治疗炎症疾病的处方，包括痛风、哮喘、银屑病等。木犀草素的抗炎作用归因于抑制诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的表达和一氧化氮（NO）的产生，清除活性氧（ROS），抑制ROS 的产生和抗氧化酶的激活，抑制白三烯的产生和释放等[26]。相关银屑病研究结果显示，木犀草素能够在体内和体外调节HSP90 的表达水平和外泌体分泌，缓解银屑病[27]。汉黄芩素（wogonin）是从多年生唇科植物黄芩中提取的，其分子式为C16H12O5，具有抗炎、抗氧化、神经保护、抗肿瘤和抗病毒活性等药理作用，目前关于汉黄芩素的研究主要集中于肿瘤、糖尿病肾病、关节炎等疾病[28]。已有研究[29]表明，汉黄芩素通过内源性线粒体介导和外源性受体介导的途径抑制肿瘤细胞生长。此外，NF-κB 通路在汉黄芩素调控细胞增殖中发挥重要作用[29-31]。以上研究表明，汉黄芩素在很大程度上有助于防止细胞永生化和肿瘤的发生，但其在治疗银屑病中的作用发掘仍属首次。

本研究中，基因KEGG富集结果提示，白鲜皮的主要有效成分调控银屑病可能通过免疫与炎症相关通路。最新的研究表明，除了INF-γ 与IL-2诱导分化的Th1细胞参与外，以分泌IL-17为特征的Th17 细胞也深入参与了银屑病的发展过程。IL-17诱导中性粒细胞、T细胞和DC趋化因子，导致中性粒细胞、记忆T 细胞和DC 的聚集[32]。在IL-17 的刺激下，角质形成细胞产生IL8/CXCL8、GRO/MGSA/CXCL1、CXCL3、CXCL5 和CXCL6 因子，诱导驱动中性粒细胞迁移到表皮，产生活性氧中间体与蛋白水解酶，导致局部组织破坏[33]。角化细胞来源的CCL20可能对炎症T细胞和树突状细胞起中央趋化作用，并可能提供自分泌环路来增加Th17细胞本身的聚集[33]。IL-17通过CCL20将携带CCR6 的DC 和记忆T 细胞带入病变部位。IL-22通过下调控制末端分化的基因引起角化细胞异常增殖，导致分化改变和角化不全[34]。IL-17A 与IL-17F 可以通过与受体结合招募TRAF-7 激活NF-κB、MAPK、C/EBP 通路，以及调节细胞因子的表达，促进银屑病发展；IL-17C 通过受体复合物和Act1 提高宿主防御，与TNF 起协同作用，增强上皮表面的保护性抗菌免疫反应；IL-17E 诱导DC 细胞表达IL-1β，进而增强Th17 细胞介导的炎症[35]；IL-17B 被认为可以促进炎症反应，而IL-17D可以调节内皮细胞产生细胞因子[36]。

本研究应用网络药理学研究发现，汉黄芩素可能通过对TNF- α、 IL- 6、 NF- κB、 TP53、HSP90AA1、ESR1、PTGS2、PPARG基因的调控作用起到治疗银屑病的作用，并对此进行了细胞学验证。既往研究发现，TNF-α 和IL-6 是临床常见炎性细胞因子，与银屑病的发生发展密切相关[37]。TNF-α可由巨噬细胞、单核细胞以及T细胞和B细胞产生，在银屑病的发病机制中是一种重要的促炎细胞因子。据报道，在银屑病组织和血清中观察到TNF-α 升高[38-39]。TNF-α 可激活NF-κB 通路，增加黏附分子和血管内皮生长因子生成，促进细胞增殖[40]。皮肤和血清中IL-6 水平的升高是银屑病的一个重要特征，抑制IL-6 表达已成为银屑病的治疗靶点[41]。TP53 是抑癌机制的关键基因之一，可抑制细胞生长，在银屑病患者皮损中呈高表达[42]。由TP53 编码的P53 蛋白被称为“基因组卫士”。在细胞周期中，P53 不仅可以通过p21的表达修复细胞周期停滞在G1 期，还可以通过Bcl2/Bax 途径介导细胞死亡[43]。研究发现，P53 是调节银屑病表皮细胞凋亡过程的重要蛋白质[44]。一项临床研究使用紫外线治疗银屑病，治疗后发现P53 和Foxp3 表达显著降低，推测P53 是紫外线诱导Foxp3 转录所必需的蛋白质[45]。HSP90AA1 是HSP90的一种胞浆形式，也是IL-17信号通路上的因子，银屑病皮损组织中HSP90 与IL-6 的表达有明显的正相关性[46]。ESR1 的表达激活可促进银屑病炎症的发生发展[47]。PTGS2在银屑病皮损中高表达，且与血管增生存在显著相关[48]，PTGS2基因编码的环氧合酶-2（COX-2）通过分泌炎症信号分子加速花生四烯酸的代谢，放大炎症[49]。此外，PTGS2 被认为是铁死亡细胞的典型潜在生物标志物，PTGS2 mRNA在银屑病皮损中升高，这已被作为铁死亡参与银屑病发展过程的生物标志物进行研究[50]。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是一类依赖于配体的核激素受体，包括PPARα、PPARβ/δ 和PPARγ（又名PPARG）。PPARγ 主要表达于表皮的角质层[50-51]，具有抗炎作用[52]。在皮肤中，PPAR调节炎症、脂质合成、角质形成细胞分化和增殖[53]。此外，PPAR 参与包括毛囊和皮脂腺在内的皮肤附属物的内稳态，所有3个PPAR 的激活都能提高急性皮肤破坏后屏障的恢复。PPARγ激活被证明可以改善银屑病患者的皮肤病变[54-55]，临床上已经出现抗炎症和抗增殖的PPARγ 调节剂[56]。本研究使用1 μg/mL LPS 进行HaCaT 细胞银屑病样模型造模，检测不同时间点炎症相关因子TNF-α、IL-6、NF-κB上升水平，结果显示，LPS诱导4 h 后细胞TNF-α、IL-6、NF-κB 表达上升最为明显，表明HaCaT 细胞银屑病样模型构建成功。应用10% IC50汉黄芩素干预HaCaT 细胞银屑病样模型，结果发现汉黄芩素可以下调ESR1、HSP90AA1、 IL- 6、 NF- κB、 PTGS2、 TNF- α、TP53 mRNA 的表达，提高PPARG 的mRNA 表达。进一步证实了汉黄芩素可能通过上述靶点调控细胞周期、氧化应激及炎症因子发挥对银屑病的治疗作用，是治疗银屑病的潜在药物。

综上所述，本研究利用网络药理学探讨白鲜皮治疗银屑病的关键活性成分及其主要调节的靶点，发掘出了槲皮素、木犀草素以及汉黄芩素等3 个重要活性成分。对其中汉黄芩素的治疗作用进一步实验分析发现，其治疗银屑病的作用机制主要与调控TNF-α、IL-6、NF-κB、TP53、HSP90AA1、ESR1、PTGS2、PPARG mRNA 表达，降低炎性水平有关。