基于NF-κB通路探究亚麻油干预心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制

耿 芸,宋海燕,刁学织

心肌梗死是指急性心肌缺血坏死,是临床常见的疾病。心肌梗死早期症状主要以疼痛为主,临床表现主要是突然发作的胸口压榨性疼痛,程度较重,持续时间长,可达数小时或更长,休息及含服硝酸甘油无效,疼痛可放射至下颌、颈部、背部;有时也可表现为全身症状、心律失常、胃肠道症状等[1-3]。心肌梗死后心脏会进行心室重塑,细胞外胶原基质不断沉积,成纤维细胞增殖,导致心肌细胞肥大、心肌纤维化及细胞凋亡[4-5]。其中心肌纤维化在心室重塑中起重要作用,心肌纤维化是心肌的自我修复和炎症反应过程,如果纤维化加重,则心肌僵硬度增加,顺应性下降,导致心脏舒张功能受损,纤维化增加,使具有收缩功能的心肌细胞比例减少,从而导致心脏收缩功能受损[6-7]。心肌纤维化的发生和肾素-血管紧张素-醛固酮系统、炎症反应、多种细胞因子及细胞自噬等各种因素相互作用有关。核转录因子-κB(NF-κB)是一种广泛的转录因子,能和很多基因结合,参与炎症、免疫应答、细胞增殖凋亡等多种活动。有研究表明,心血管疾病的发生多与NF-κB信号通路有关[8]。亚麻籽富含α-亚麻酸、亚麻酸及木酚素等功能性成分,其中,α-亚麻酸是一种植物来源的n-3必需脂肪酸,是长链n-3不饱和脂肪酸二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的前体物质。有研究表明,膳食补充α-亚麻酸对心血管疾病的预防和治疗有重要的作用[9]。心肌纤维化会造成心室重塑,导致心功能下降,传导障碍,诱发心律失常、心力衰竭等。因此,预防心肌纤维化是心肌梗死病人治疗的关键。本研究基于NF-κB通路探究亚麻油干预心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 54只SD大鼠(雌雄各半),辽宁长生生物技术股份有限公司提供,体质量190～220 g,温度(22±1)℃,分6笼饲养,湿度45%～55%,大鼠活动饮水自由,给予1周时间习惯新环境,按照《实验动物管理条例》规定进行实验,动物许可证号:SYXK(辽)2019-0034。

1.2 药物、试剂与仪器 冷榨亚麻籽油(α-亚麻酸质量分数56%)购自上海西格生物科技有限公司;卡托普利(国药准字H19993135,规格:每片25 mg)购自云南龙恩制药有限公司;一抗、二抗购自杭州联科生物技术股份有限公司;小动物超声购自上海玉研科学仪器有限公司;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;Masson染色购自无锡菩禾生物医药;蛋白电泳仪购自北京德元国际科技公司;三乙醇胺(TBS)缓冲液购买自滁州仕诺达生物科技有限公司。

1.3 建模及分组 分组:将54只大鼠随机分为6组,每组9只,假手术组(control group,CO组)、模型组(model group,MO组)、亚麻油低剂量组(linseed oil low dose group,LL组)、亚麻油中剂量组(linseed oil medium dose group,LM组)、亚麻油高剂量组(linseed oil high dose group,LH组)、卡托普利组(captopril group,CA组)。建模:术前禁食水,腹膜内注射2%戊巴比妥钠,使大鼠充分麻醉后,经喉气管插管连接小动物呼吸机,胸部备皮消毒后,沿左侧3～4肋间间隙开胸,撕开心包膜后可见心脏。心脏大静脉作为标记,使用5-0带线缝合针于左心耳下缘约2 mm位置结扎左冠状动脉前降支。观察左心室心肌的运动及颜色变化,室壁运动减弱、结扎部位及周围心肌变白认为手术结扎成功。术后第2天进行心电图检查,图纸中出现5～8个病理性Q波(观察Ⅰ、aVL、V1～V6导联)、ST段抬高,表明模型制备成功。CO组大鼠则将手术线穿过肺动脉圆锥与左心耳之间,不进行结扎,且无上述病理表现。

1.4 干预方法 建模成功后,LL组大鼠给予亚麻油0.025 g/kg灌胃,LM组大鼠给予亚麻油0.050 g/kg灌胃,LH组大鼠给予亚麻油0.150 g/kg灌胃,CA组大鼠给予卡托普利10 mg/kg灌胃,以上用药均为每日1次,共干预4周,CO组及MO组大鼠不用药,给予等体积生理盐水灌胃。

1.5 超声检测大鼠心脏功能 以2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,使用小动物超声仪器绘制大鼠超声心电图,检测大鼠心功能。探头置于大鼠胸骨左缘3～4肋间,测量左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室短轴缩短率(LVFS)参数。

1.6 心肌组织病理学和心肌纤维化程度观察

1.6.1 心肌组织HE染色 用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,大鼠处死后分离心脏,取心肌组织,置于4%多聚甲醛液固定24 h,梯度乙醇脱水,透明,浸蜡包埋、切片取5 μm厚度,用二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,水洗5 min,HE染色10 min,水洗,再次梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光镜下观察心肌组织变化。

1.6.2 心肌组织Masson染色 取大鼠心肌组织,遵照Masson染色试剂盒操作说明处理,封片后通过显微镜观察心肌纤维化程度(肌纤维呈红色,胶原呈蓝色)并照相保存;通过图像分析系统计算胶原容积分数(CVF),CVF(%)=(胶原面积/视野总面积)×100%,每张切片随机取5个视野测量,取平均值。

1.7 聚合酶链式反应(PCR)法检测大鼠心肌组织中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、结缔组织生长因子(CTGF)表达 取心肌组织50 mg放于酶EP管中,加入Trizol 1.0 mL,无核酸酶溶解,按照试剂盒提取总RNA后,进行纯化,收集纯化后的总RNA。取RNA母液10 μL加焦磷酸二乙酯(DEPC)水990 μL稀释100倍,采用紫外线分光光度仪器检测RNA纯度,并计算浓度。按照逆转录试剂盒逆转录反应体系,将提取的RNA转录为cDNA,获得反应体系,反应条件为:42 ℃作用60 min,72 ℃作用5 min,4 ℃终点。每个细胞设置6个复孔,以β-actin为内参,反应条件为95 ℃预作用3 min,95 ℃作用5 s,58 ℃退火,40个循环。详见表1。

表1 基因名称及引物序列

1.8 免疫印迹法检测大鼠心肌组织中NF-κB、NF-κB p65、TNF-α蛋白的表达 取大鼠心肌组织,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后切碎,再加1 mL细胞裂解液裂解30 min,10 000 r/min、4 ℃离心5 min,取上清液,上样,缓冲液混合于PBS稀释蛋白样品中,按照4∶1的比例进行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用双辛可宁酸(BCA)法检测总蛋白浓度,每孔上样蛋白量20 μg,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。转印缓冲液配制好后放入4 ℃冰箱内预冷,然后全部转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再加入脱脂奶粉,全程封闭时长为1 h。加入一抗NF-κB、NF-κB p65、TNF-α(稀释比例1∶1 000)后,TBS20(TTBS)漂洗,共3次,每次10 min;4 ℃过夜,加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(稀释比例1∶1 000),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,用博士德生产的二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒,在1 mL水中加A、B、C液各1滴,再加于膜上,电化学发光法(ECL)凝胶成像系统分析目标条带的光密度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠超声检测指标比较 与CO组相比,MO组LVFS、LVEF降低,LVESD、LVEDD升高(P<0.05);与MO组相比,LL组、LM组、LH组、CA组LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);与LL组相比,LM组、LH组和CA组LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);与LM组相比,LH组和CA组LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05),LH组和CA组相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠超声检测指标比较

2.2 HE染色结果 CO组大鼠左心室的心肌细胞彼此平行,且在光学显微镜下呈有序排列。细胞结构未被破坏,大小正常,中心是椭圆形的核,横向条纹明显可见。MO组大鼠心肌细胞萎缩,细胞色素沉着,细胞质增生,心肌纤维断裂,炎性细胞大量浸润,纤维细胞增加。LL组、LM组、LH组、CA组染色相对均匀,梗死部位的纤维组织增生和炎性细胞浸润、细胞结构破坏程度较模型组改善,其中,LH组和CA组改善效果较LL组和LM组明显。详见图1。

图1 HE染色观察各组大鼠心肌组织病理形态学(×200)

2.3 Masson染色结果及CVF值 CO组大鼠心肌组织排列整齐,染色均匀,基本无胶原纤维;MO组大鼠心肌组织破坏严重,心肌细胞残存较少,胶原纤维增加,出现明显心室重塑表现;各用药组染色相对均匀,与MO组相比,完整的心肌细胞增多,胶原纤维不同程度减少,其中,LH组和CA组改善效果较LL组和LM组明显,心肌纤维化程度较轻。详见图2。

图2 Masson染色观察各组大鼠心肌组织病理形态学(×200)

通过Image J图像分析软件计算各组大鼠心肌CVF结果,CO组、MO组、LL组、LM组、LH组和CA组CVF分别为(0.91±0.15)%,(22.01±1.17)%,(13.15±3.24)%,(8.48±0.76)%,(5.63±1.07)%,(5.57±0.98)%。与CO组相比,MO组CVF值明显升高(P<0.05);与MO组相比,其他药物干预组CVF值明显降低(F=203.700,P<0.05),各亚麻油治疗组间CVF值随亚麻油治疗剂量增加而降低(P<0.05),LH组和CA组CVF值降低最明显,组间比较差异无统计学意义(t=0.124,P=0.902)。详见图3。

MO组与CO组比较,＊ P<0.05;与MO组比较,#P<0.05;与LL组比较,△ P<0.05;与LM组比较,※ P<0.05。

2.4 各组大鼠心肌组织中HIF-1α、CTGF mRNA表达比较 与CO组相比,MO组大鼠心肌组织中CTGF mRNA表达增加,HIF-1α mRNA表达下降(P<0.05);与MO组相比,LL组、LM组、LH组、CA组HIF-1α mRNA表达增加,CTGF mRNA表达降低(P<0.05);与LL组相比,LM组、LH组和CA组HIF-1α mRNA表达增加,CTGF mRNA表达降低(P<0.05);与LM组相比,LH组和CA组HIF-1α mRNA表达增加,CTGF mRNA表达降低(P<0.05),LH组和CA组相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌组织HIF-1α、CTGF mRNA表达比较

2.5 各组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达比较 与CO组相比,MO组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.05);与MO组相比,LL组、LM组、LH组、CA组NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05);与LL组相比,LM组、LH组和CA组NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05);与LM组相比,LH组和CA组NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05),LH组和CA组相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4、图4。

图4 各组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达条带图

表4 各组大鼠心肌组织NF-κB、TNF-α、NF-κBp65蛋白表达比较

3 讨 论

急性心肌梗死是心血管疾病死亡的主要原因之一,我国急性心肌梗死的发病率不断升高,死亡率也呈整体上升趋势,高额的医药费用造成严重的经济负担,同时也影响人们的生活质量[10-11]。在心肌梗死发生后,缺血心肌释放的细胞因子通过各种信号通路被激活,引起心肌细胞和成纤维细胞的过度增殖及细胞外基质的沉积,最终诱发心肌炎症反应、心肌纤维化及心功能障碍,因此,抑制炎症反应可以减轻心脏纤维化程度及心肌损伤。有研究发现,亚麻油对冠状动脉血管发生动脉粥样硬化造成的血管狭窄和堵塞所引起的心肌缺氧、坏死的心脏病有一定治疗作用[12]。因此,本研究基于NF-κB通路探究亚麻油干预心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制。

本研究发现,经过亚麻油干预后,NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达降低,说明亚麻油对心肌梗死大鼠纤维化有保护作用,可以抑制炎症反应,防止斑块的形成、破裂,对心肌细胞损伤有一定的保护作用。卡托普利能作用于心脏的肾素-血管紧张素系统,阻断血管紧张素Ⅱ并下调转化生长因子β,从而抑制心肌梗死后的胶原增生,改善心肌纤维化。但是卡托普利有较多的不良反应,可引起心悸、蛋白尿、味觉迟钝等。亚麻油对人体健康有益,具有增强人体免疫力、预防癌症等多种功效[13]。近年来,心血管疾病的危险因素研究中炎性因子引起众多学者的关注,NF-κB广泛存在于包括心肌细胞、血管内皮细胞在内的各种细胞中,具有基因转录多向调控作用。急性心肌梗死发生时氧化应激可诱导NF-κB激活,活化的NF-κB经细胞外的正反馈途径,增强TNF-α基因转录,使TNF-α产生和释放增多,而TNF-α作为NF-κB激活剂,再次激活NF-κB,导致最初的炎症信号进一步放大[14]。TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子,TNF-α通过促进基质蛋白溶解,抑制血管平滑肌细胞的胶原蛋白基因表达和胶原合成参与斑块形成和破裂,从而促进心肌梗死的发生发展和并发症的发生。

孙治霞等[15]通过对心肌梗死大鼠的研究发现,心肌梗死后NF-κB信号通路相关炎性因子TNF-α、NF-κB表达增加,NF-κB DNA结合活性增加,提示心肌梗死后NF-κB通路被激活,同时TNF-α、NF-κB表达降低,可以防止心肌细胞的损伤,抑制心肌梗死大鼠心肌纤维化。已有研究表明,亚麻油中α-亚麻酸对血栓的形成有一定的抑制作用,能够改变血液流动性,预防心脑血管疾病,同时亚麻油中的亚麻籽蛋白可以保护心脏[16]。Ni等[17]研究发现,亚麻油可以增强免疫力,同时亚麻油中α-亚麻酸可调节子宫内膜异位症小鼠模型的肠道微生物群,降低脂多糖引起的局部炎症,有较好的抗炎作用。

本研究发现,MO组大鼠LVFS、LVEF降低,LVESD、LVEDD升高,说明心肌梗死大鼠心脏舒张功能受损。经过亚麻油干预后LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低,说明亚麻油可改善大鼠心脏的收缩和舒张功能,减轻心肌纤维化损伤,保护心肌。HE染色显示,MO组大鼠心肌细胞结构疏松且有断裂、排列紊乱、炎性细胞增多,有明显出血坏死。Masson 染色可见MO组大鼠大片蓝色的心肌胶原沉积于心肌细胞及血管周围;MO组大鼠心肌纤维化指标CVF较CO组显著升高,说明MO组心肌纤维化严重、心肌肥厚显著。经过亚麻油干预后发现,亚麻油可以增加心室壁的顺应性,改善大鼠心功能,抑制心室重构,逆转心肌纤维化。亚麻油具有抑制心脏成纤维细胞DNA的合成,从而减轻胶原增生,抑制心肌纤维化作用。有研究表明,亚麻油在预防冠心病、糖尿病、结肠癌和减重等方面有一定的效果[18]。本研究发现,经亚麻油干预后,HIF-1α mRNA表达增加、CTGF mRNA表达降低,说明大鼠心功能得到了改善,亚麻油可提高HIF-1α的表达,降低CTGF的表达,从而对心肌梗死大鼠心肌纤维化起到抑制作用。有研究认为,引起心肌纤维化的主要机制是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活,该系统中的关键活性成分为血管紧张素Ⅱ,其可以激活和促进一系列生长因子(如TNF-α、CTGF等)表达,最终引起细胞外基质的大量积聚,导致纤维化的发生。HIF-1α是在低氧条件下产生的一种内源性关键的氧敏感转录因子,在生理和病理条件下调控多种基因表达,从而发挥机体对低氧或缺血的保护性适应。CTGF是与各种器官组织纤维化过程密切相关的细胞因子.能促进成纤维细胞增殖,促进细胞外基质合成。有研究发现,HIF-1α可以降低炎性因子的表达,并且其作用机制和抑制NF-κB通路有关。HIF-1α活化后能够降低心肌酶活性,改善心肌组织形态,抑制心肌细胞凋亡,降低心肌梗死面积,从而改善心肌梗死后心肌纤维化损伤[19]。Parikh等[20]通过对心肌梗死大鼠进行研究,发现经过亚麻油干预后,大鼠心律失常的发生率降低,心肌纤维化及TNF-α表达降低,说明亚麻油可以预防和治疗心肌梗死后的心律失常,同时还能保护心肌,与本研究结果一致。

综上所述,亚麻油可以抑制大鼠心肌纤维化,改善心功能,对心肌梗死大鼠心肌起保护作用,其作用机制可能与调控NF-κB相关信号通路有关。