疏肝益肾活血汤对乳腺癌化疗后临床疗效、卵巢损伤修复及BMP-15、miRNA-503表达的影响*

王敏,张梦馨,黄辉,张静知

陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712000

乳腺癌是当今女性恶性肿瘤发病率最高的肿瘤类型之一,也是女性因癌症死亡的主要原因之一。该病发病率逐年上升且日趋年轻化,且随着年龄增加而上升[1]。目前,临床认为乳腺癌的发生与乳腺疾病、精神压力、月经周期、产龄、产次等因素有关。早期乳腺癌患者以手术治疗辅助放射治疗;Ⅱ—Ⅲ期患者则主要以手术治疗后根据患者临床情况决定辅助化疗或放疗方案[2]。化疗可清除手术后体内参与的恶性肿瘤细胞,提高手术的治愈率。研究表明,乳腺癌化疗可能导致卵巢功能损伤[3]。乳腺癌属中医“乳岩”“乳石痈”等范畴。中医认为,本病的发病主要与脾肾亏虚、血虚肝郁有关。疏肝益肾活血汤以清代名医高鼓峰的《医宗己任编》卷一“疏肝益肾汤”为底方,经过临床多年应用,发现对乳腺癌有较好的疗效。本研究观察疏肝益肾活血汤对乳腺癌化疗后临床疗效、卵巢损伤修复及骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP-15)、miRNA-503表达的影响,并分析其发挥疗效的作用机制,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取80例乳腺癌患者纳入本次前瞻性研究,受试范围为2019年6月至2021年6月在陕西中医药大学附属医院进行统一化疗的患者。所有患者按照随机数字表法分为对照组和试验组各40例。对照组患者年龄20～40(22.45±7.55)岁;肿瘤分期:Ⅱ期18例,Ⅲ期22例;病理类型:浸润性导管癌25例,浸润性小叶癌15例。试验组患者年龄20～42(22.52±8.48)岁;肿瘤分期:Ⅱ期14例,Ⅲ期26例;病理类型:浸润性导管癌28例,浸润性小叶癌12例。两组患者年龄、肿瘤分期、病理类型等一般资料经统计学处理,差异无统计学意义,具有可比性(P>0.05)。本研究经陕西中医药大学附属医院医学伦理会审查通过(批号:0019N-106)。

1.2 诊断标准

1.2.1 乳腺癌西医诊断标准符合《中国临床肿瘤学会(CSCO)乳腺癌诊疗指南2020》[4]相关标准并根据病理或细胞学确诊为乳腺癌;经美国临床肿瘤学会(ASCO)/美国病理学家学会(CAP)发布的乳腺癌人类生长因子受体-2检测指南[5]确认人类生长因子受体-2阴性。

1.2.2 乳腺癌中医辨证标准参考《肿瘤中医诊疗指南》[6]“脾肾亏虚证”兼“血虚肝郁证”辨证要点:乳房肿块,倦怠乏力,腰膝酸软或腰痛,食少纳呆,肢体麻木,口淡不渴,肌肤甲错,舌淡有齿痕或苔白、厚腻或舌质紫黯有瘀点、瘀斑,脉沉细、涩。

1.3 病例纳入标准(自拟)(1)经病理组织学确诊的女性乳腺癌患者,中医辨证为肝肾阴虚证兼血瘀证;(2)年龄为20～42周岁、TNM病理分期为Ⅱ—Ⅲ期的患者;(3)预计生存期在6个月以上的患者;(4)雌激素受体(ER)和(或)孕激素受体(PR)阳性,人类生长因子受体-2阴性患者;(5)KPS功能状态评分大于60分的患者;(6)非中药过敏体质的患者;(7)签署知情同意书的患者。

1.4 病例排除标准(自拟)(1)其他恶性肿瘤转移至乳腺的转移性乳腺癌患者;(2)合并心脏、脑、肝脏、肾脏等严重原发病的患者;(3)月经规律的患者;(4)参与治疗前有激素类药物用药史的患者。

1.5 病例脱落标准(自拟)(1)主观上不能按疗程服药或服药依从性较差的患者;(2)不良反应严重(指严重反应但不危及生命而是延长治疗时间)的患者。

1.6 治疗方法所有患者均行TE化疗方案,具体用药如下:多西紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer S.A.,X20010340,每支20 mg,0.5 mL)60 mg·m-2,第1天静脉滴注;表柔比星[辉瑞制药(无锡)有限公司,国药准字H20000496,10 mg]60 mg·m-2,第1天静脉推注。3周为1个化疗周期,连续治疗两个周期。试验组在TE化疗方案基础上给予疏肝益肾活血汤,方药组成:柴胡12 g,生黄芪30 g,山药 15 g,枸杞子12 g,女贞子12 g,半枝莲9 g,党参 12 g,山慈菇9 g,白花蛇舌草15 g,白芍12 g,丹参 9 g,甘草6 g。以上药物由陕西中医药大学附属医院中药房统一制药装袋,每剂400 mL,早晚饭后分次温服。3周为1个疗程,连续服用两个疗程。

1.7 观察指标(1)观察两组患者治疗后3个月、6个月、12个月的月经状态和月经恢复时间。(2)采用流式细胞仪(Beckman公司)检测两组治疗前后外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平。(3)采集两组患者治疗前后外周静脉血并分离血清和血浆,低温保存送检。采用化学发光仪(Beckman公司)检测对照组和试验组血清血清雌二醇(estradiol,E2)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP-15)水平。(4)采用酶联免疫吸附法测定两组治疗前,治疗后3个月、6个月、12个月的血清卵巢抗缪勒管激素(ovarian anti Mullerian hormone,AMH)水平。(5)采用实时荧光聚合酶链式反应测定两组治疗前后血浆miRNA-503表达,步骤严格按照RNA提取、逆转录、PCR扩增进行,miRNA试剂盒购自德国Qiagen公司,荧光定量PCR仪购自美国ABI公司,引物合成于上海生工生物工程有限公司,序列如下:miRNA-503上游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,miRNA-503下游引物5′-GCTAGCAGCGGGAACAG-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。(6)观察两组患者不良反应发生情况,包括胃肠道反应、血小板减少、粒细胞减少、肝肾功能损害等。

1.8 临床疗效判定标准根据RECIST评价标准评估两组患者疗程结束后肿瘤复发和转移情况[7]。完全缓解(complete remission,CR):可测量病灶全部消失;部分缓解(partial remission,PR):可测量病灶直径之和减少超过30%;疾病稳定(stable disease,SD):可测量病灶直径之和增加未到PD标准或减少未到PR标准;疾病进展(progressive disease,PD):可测量病灶直径之和增加>20%。

有效率=(CR+PR)/n×100%

2 结果

2.1 两组患者临床疗效比较试验组有效率(57.50%)明显高于同期对照组(30.00%),差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组患者临床疗效比较 例

2.2 两组患者不同时间月经状态比较治疗后3个月,两组患者闭经人数比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后6个月和治疗后12个月,试验组闭经人数均少于同期对照组,差异有统计学意义(P<0.05);试验组月经恢复时间短于对照组(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组患者不同时间月经状态比较

2.3 两组患者治疗前后免疫功能比较治疗后,两组患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平均显著高于治疗前(P<0.05),试验组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平显著高于同期对照组(P<0.05),治疗后两组患者CD8+显著低于治疗前(P<0.05),试验组CD8+显著低于同期对照组(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 两组患者治疗前后免疫功能比较

2.4 两组患者治疗前后E2、FSH、LH水平比较治疗后,两组患者血清FSH、LH水平显著高于治疗前(P<0.05),试验组血清FSH、LH水平显著高于同期对照组(P<0.05);两组患者血清E2水平显著低于治疗前(P<0.05),试验组血清E2水平显著低于同期对照组(P<0.05),见表4。

表4 两组患者治疗前后E2、FSH、LH水平比较

2.5 两组患者治疗前后BMP-15、AMH水平及miRNA-503表达比较治疗后,两组患者BMP-15、和miRNA-503水平显著低于治疗前(P<0.05),试验组BMP-15、miRNA-503水平显著低于同期对照组(P<0.05);治疗前和治疗后3个月,对照组和试验组AMH水平无明显差异(P>0.05),治疗后6个月和治疗后12个月试验组AMH水平显著低于同期对照组(P<0.05),见表5、表6。

表5 两组患者治疗前后BMP-15水平、miRNA-503表达比较

表6 两组患者不同时间AMH水平比较

2.6 两组患者不良反应比较治疗期间对照组胃肠道反应9例,血小板减少5例,粒细胞减少7例,肝功能损伤2例;试验组胃肠道反应6例,血小板减少3例,粒细胞减少4例,肝功能损伤1例,肾功能损伤1例。所有患者不良反应均不严重,经对症治疗后缓解。

3 讨论

化疗是乳腺癌术后主要的治疗方式,但化疗药物对正常卵母生殖细胞的无差别损伤可导致卵巢功能减退。中医疗法具有疗效安全、温和的特色,有助于提高患者免疫功能,因此,在乳腺癌术后化疗的辅助治疗中具有独特作用。

乳腺癌属中医“乳岩”“乳石痈”等范畴。《诸病源候论》言:“石痈之状,微强不甚大,不赤微痛热……但结核如石。”《妇人大全良方》则描述乳岩“若初起内结小核,或如鳖棋子,不赤不痛,积之岁月,渐大如巉岩……此属肝脾欲怒,气血亏损”,认为本病的发生与肝郁、血瘀有关。中医认为,肝与乳房密切相关。《医学入门》记载“肝肾不足,冲任失调”,情志不畅,肝失条达,气血不畅则肾阳不足,脾失健运,难以蒸腾运化水湿,水饮凝聚成痰,日久则由气血痰瘀互结形成乳岩。此外,由于后天手术、化疗等治疗对患者进一步耗损气血,导致气血生化无源,进一步亏虚。正气不足,肝肾亏虚,邪气阻滞,痰瘀凝滞,均为本病发生的重要因素。因此,扶正固本、疏肝益肾、调节脏腑、活血化瘀对于乳腺癌的治疗具有重要意义[8-9]。

疏肝益肾活血汤是陕西中医药大学附属医院治疗乳腺癌多年的经验方,对乳腺癌有较好的疗效。方中柴胡、白芍为君药,柴胡疏肝解郁,白芍养肝敛阴,二药一散一收,配伍后既养肝体又养肝用;生黄芪、山药、党参、丹参为臣,其中生黄芪补益元气,配伍山药健脾益气,以补正气不足,党参、丹参行气活血、逐瘀生新;佐之枸杞子、女贞子滋补肝肾,白花蛇舌草、半枝莲清热解毒,山慈菇抗癌散结;甘草为使,可调和诸药药性。全方共奏疏肝益肾、补气养阴、清热解毒、活血散结之功。王宇等[10]发现,白花蛇舌草可显著抑制肿瘤细胞G0和G1期的增殖活动,且具有明显的促进细胞凋亡的作用,这一作用存在显著的“量-效”关系。杜江洋等[11]发现,白花蛇舌草配伍半枝莲呈浓度依赖性提高周期抑制蛋白p21的表达水平,抑制PCNA的表达,抑制p38、JNK、ERK的磷酸化水平,提高VASP在Ser157和Ser239位点的磷酸化,部分通过cAMP/cGMP和抑制MAPK信号通路而诱导MDA-MB-231的凋亡,发挥抗乳腺癌的作用。杨楠等[12]发现,柴胡皂苷D可通过降低HIF-1、VEGF蛋白的表达和升高IGFBP-6蛋白的表达抑制人三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖。

本研究结果表明,试验组有效率(57.50%)明显高于同期对照组(30.00%),说明疏肝益肾活血汤对乳腺癌化疗后肿瘤抑制效果较好。治疗后,试验组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平显著高于同期对照组(P<0.05),试验组CD8+显著低于同期对照组(P<0.05),说明疏肝益肾活血汤可提高机体免疫水平,原因可能在于黄芪皂苷Ⅱ可能通过激活CD45蛋白酪氨酸磷酸酯酶介导Th1淋巴细胞克隆性增殖、活化及Th1细胞因子的产生,从而促进CD4+T细胞活化效应,进而改善机体免疫功能[13]。雌激素是反映女性内分泌水平的重要指标。E2分泌过高,同时FSH、LH分泌减少说明乳腺上皮细胞以及纤维组织增生活性强,存在更高的乳腺癌变风险[14]。治疗后,试验组血清FSH、LH水平显著高于同期对照组(P<0.05),试验组血清E2水平显著低于同期对照组(P<0.05),说明疏肝益肾活血汤可改善雌激素分泌情况。孙婉娟等[15]研究报道,藏党参正丁醇萃取物有助于降低大鼠血清E2水平,提高FSH、LH以及孕酮水平,同时可改善大鼠体内抗氧化活性,与本次研究结果一致,反映了疏肝益肾活血汤对血清性激素以及内分泌激素具有一定的调节作用。

化疗药物的应用可能会导致卵巢功能损伤,原因在于化疗药物在诱导细胞凋亡的同时不可避免地导致正常卵母细胞死亡,直接导致生殖细胞丢失以及卵巢早衰[16-18]。刘思旋等[19]发现,环磷酰胺辅助化疗方案可明显减少小鼠卵巢卵泡数量,并降低患者血清AMH水平,且年龄越大卵巢的不可逆性损伤程度越严重。这是由于环磷酰胺的活性代谢物可与谷胱甘肽结合,从而增加氧化应激并处罚卵巢细胞凋亡效应,其他的化疗药物也有类似的效应,产生细胞抑制药效的同时破坏了卵母细胞的DNA,例如双链DNA断裂,以致触发凋亡[20]。AMH是反映卵巢储备功能的生物标志物之一,这是由于直径>8 mm的卵泡几乎不分泌AMH,因此,AMH分泌量过高提示了机体内大部分为直径<4 mm 的小窦卵泡[21]。BMP-15在卵母细胞中表达,可促进颗粒细胞增殖并通过抑制颗粒细胞表面FSHR的表达来选择优势卵泡,阻止孕酮生成并抑制卵母细胞正常生长[22-23]。miRNA-503则可通过抑制血管生成影响卵巢动脉的血流灌注,血流灌注降低则无法为卵泡的成熟提供循环支持,从而导致卵巢储备功能下降[24]。治疗后,实验组 BMP-15、AMH和miRNA-503水平显著低于同期对照组(P<0.05),说明,疏肝益肾活血汤有助于抵抗并减轻化疗带来的卵巢损伤。

综上所述,疏肝益肾活血汤对乳腺癌化疗后肿瘤抑制效果较好,有助于提高机体免疫水平,改善雌激素分泌情况,抵抗并减轻化疗带来的卵巢损伤。但本次研究受限于研究观察时间和样本数量,观察结果仅能作为一种治疗方式的参考,未来研究中仍需通过扩大病例样本数量、延长随访时间等方式观察其对患者的远期影响。