2型糖尿病肾病患者血清代谢组学分析构建预后预测模型研究

陈筱涛，刘 韵，龙碧莹，郭皖北（湘南学院附属医院内分泌科，湖南郴州 423000）

2 型糖尿病肾病（type 2 diabetic nephropathy,T2DN）在世界范围内较为常见，临床特点为蛋白尿、水肿、高血压等，有学者认为[1]，T2DN 常与糖尿病微血管病变密切相关，严重影响患者预后情况，因此准确的判断患者预后水平尤为重要[2-4]。代谢组学具有高通量、操作简便、定量分析的优点，可对疾病进行早期诊断及机制探讨，是目前应用最为广泛的医学技术之一[5-7]。由于患者发生低水平慢性炎症可导致胰岛素抵抗、T2DN 及其他并发症，依赖代谢组学技术可监测机体内部已经发生的炎症代谢产物的变化，发现疾病早期敏感生物标志物、判断疾病预后[8]。本文将统计学模型与代谢组学相结合探究T2DN 患者预后情况，采用数学模型公式和代谢组学参与研究，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，为患者的早期预后提供科学支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2014年9月～2017年9月于湘南学院附属医院接受治疗的282 例T2DN 患者为研究对象。纳入标准：年龄≥18 岁；符合T2DN诊断标准[9]。排除标准：①排除肝炎、肝硬化、肾脏严重器质性病变患者；②尿路感染；③药物过敏史；⑤贫血、重度肥胖等患者；⑤精神病史；预后观察期内，以患者死亡为研究终点，随访时间由2017年10月起始，随访时间50 个月。按照本研究中预后情况的判断标准，将患者分为预后良好组（n=199）和预后不良组（n=83）。预后良好组：年龄45～72（50.67±12.85）岁；男性103 例，女性96 例；平均病程7.55±2.34年；体温36.11±1.02℃；发热2 例，疼痛5 例，脑卒中史2 例，高血压史37 例，药物过敏史26 例，吸烟史18 例，饮酒史106 例，贫血38 例，心力衰竭3 例，呼吸机使用2 例，抗生素使用史136 例。预后不良组：年龄45～73（51.03±11.29）岁；男性44 例，女性39例；平均病程7.06±2.25年；发热1 例，疼痛2 例，脑卒中史1 例，高血压史18 例，药物过敏史14 例，吸烟史8 例，饮酒史52 例，贫血20 例，心力衰竭1 例，呼吸机使用1 例，抗生素使用史66 例。两组患者一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。本研究经伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

T2DN 预后不良定义：①肾小球滤过率下降（肾小球滤过率分级下降或基线下降＞25%）；②血肌酐(Scr)≥基线Scr 的2 倍，本研究中出现以上情况即为T2DN 预后不良。

1.2 仪器与试剂 贝克曼库尔特-AU5800 全自动生化分析仪[贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司]。Waters UPLC 超高效液相色谱系统（沃特世科技有限公司，型号：Waters ACQUITY UPLC 系统）。乙腈（生产厂家：德国CNW 科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 观察指标：记录患者一般资料，包括症状体征以及实验室检査等临床信息采集。其中一般情况主要包括年龄、性别、体重指数、血压、病程、既往史等。记录实验室指标，包括血糖项目：空腹血糖（fasting blood sugar,FBG）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,HbAlc）；血脂项目：三酰甘油（triacylglycerol,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白- 胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白-胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）；肾功能项目：血尿酸（uric acid,UA）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血肌酐（serum creatinine,Scr）。

1.3.2 代谢组学分析：患者空腹抽取静脉血5ml，以3 000r/min 的转速离心20 min 后分离血清，置于-80℃中；待测时，温度升至4℃中，振动混合均匀，取200μl 加入500μl 乙腈中，涡旋40min，4℃下12 000 r/min 离心20 min，取上清液90 μl 于96孔接收板中，采用Waters UPLC 超高效液相色谱系统，配备自动进样分析[10]。应用Markieview 软件，将相关积分值进行中心化和比例换算，同时进行正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial leastsquares discrimination analysis,OPLS-DA)寻找出特征差异性代谢物。OPLS-DA 样品分布得分图用于展示不同组间差异。根据多元统计分析中变量的载荷大小，筛查出组间具有显著性差异的化合物作为潜在生物标志物，再根据质谱同位素匹配结果和数据库的检索结果及对照品及串联质谱的鉴别结果，对潜在的生物标志物进行鉴定。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验进行比较；计数资料以率表示，采用χ2检验进行比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。采用向前逐步法明确最终纳入预测模型的变量，根据各变量对应的偏回归系数（β）构建方程，建立T2DN 患者预后预测模型。利用Hosmer-Lemeshow检验和受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve）评价预测模型的拟合优度以及预测能力。

2 结果

2.1 不同预后组间实验室指标比较 见表1。实验室指标结果显示，预后不良组的FBG，BUN，UA，TG，HbAlc 高于预后良好组，预后不良组的LDL-C，HDL-C 低于预后良好组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；Scr，TC 差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 实验室指标比较（±s）

表1 实验室指标比较（±s）

项目预后良好组（n=199）预后不良组（n=83）t 值P 值FBG（mmol/L）5.03±0.697.96±1.6710.9980.000 HbAlc（%）5.96±2.578.01±2.666.0420.000 BUN（mol/L）4.51±0.916.31±0.889.6440.000 UA（μmol/L） 331.21±81.36 411.25±79.61 4.7960.000 Scr（μmol/L） 71.65±15.29 70.96±15.440.2150.415 LDL-C（mmol/L） 2.60±0.212.53±0.191.6760.048 HDL-C（mmol/L） 1.14±0.120.95±0.117.9160.000 TG（mmol/L）1.75±0.632.18±0.334.1010.000 TC（mmol/L）5.06±1.314.98±1.220.3030.381

2.2 代谢组学研究结果 OLPS-DA 分析中的值越大对分组的贡献也越大，一般认为VIP 值＞1 具有统计学意义，这些成分可被认为是干扰正常生理代谢的潜在生物标记物，再结合t检验，筛查出组间具有显著性差异（P＜0.05）的化合物。OLPS-DA差异图结果显示，预后良好组和预后不良组的代谢状态可明显区分，见图1。

图1 预后良好组和预后不良组代谢状态OLPS-DA 差异图

2.3 潜在标志物测定结果及相关代谢途径 见表2。鉴定出差异性代谢产物，与预后良好组比较，预后不良组上调的代谢产物有溶血磷脂酰胆碱，谷氨酰胺-精氨酸，半乳糖羟赖氨酸和鹅去氧胆酸；下调的代谢产物有溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、鞘磷脂、心磷脂、二酰甘油、TG，苯丙胺酰-丙氨酸、神经节苷脂，透明质酸和磷酸二氢丙酮，差异均有统计学意义（均P＜0.05），以上代谢产物途径有脂类，氨基酸，糖类代谢。

表2 预后良好组和预后不良组比较差异标志物测定结果

2.4 生存曲线分析 T2DN 患者预后的Kaplan-Meier生存分析中，对282 例患者以纳入研究后至研究终点的时间为生存时间，以进入研究终点事件与否为因变量，比较预后良好组和预后不良组的生存差异，得出生存曲线，见图2。中位生存时间预后不良组为19 个月，预后良好组为25 个月。

图2 T2DN 患者预后的生存曲线

2.5 基于代谢组学分析构建风险预测模型对T2DN患者预后的ROC 曲线及一致性评价 根据潜在标志物测定结果构建T2DN 患者预后水平的风险预测模型，P 为模型预测概率，取值0～1。建立的预测模型如下：Logit(P) = -5.319 + 0.172(溶血磷脂酰乙醇胺) + 0.669(磷脂酰乙醇胺) +0.624(溶血磷脂酰胆碱) + 1.149(磷脂酰胆碱) + 0.841(磷脂酰甘油) + 0.271(鞘磷脂) + 0.744(心磷脂)+0.102(二酰甘油) + 0.667(TG) +0.676(谷氨酰胺-精氨酸)+ 1.067(半乳糖羟赖氨酸) + 0.802(苯丙胺酰-丙氨酸) + 0.203(鹅去氧胆酸) + 0.711(神经节苷脂) +0.034(透明质酸) + 0.494(磷酸二氢丙酮)。

根据预测概率P 与T2DN 患者预后水平的ROC曲线，见图3。曲线下面积AUC 为0.853（95%CI：0.759～0.909，P＜0.001），敏感度、特异度和约登指数分别为85.26%，82.84%和0.681，约登指数衡量了模型预测的真实性，表明该模型预测T2DN 患者预后的水平较高；校准度评价图线结果显示，校准曲线和标准曲线结果无明显偏倚，一致性较好。

图3 基于代谢组学分析构建风险预测模型对T2DM 患者预后的ROC 曲线及一致性评价

3 讨论

T2DN 在患者治疗后常出现一系列的并发症，预后效果不佳的情况时有发生，且无明显症状而不易被察觉[12]。据调查[13]，目前此病发病年龄在40岁以上，但近年来，发病年龄有年轻化趋势，严重危害人类健康，提出一种能够及时预测患者预后情况的医学技术尤为重要。另有研究表明[12]，T2DN可能导致机体神经病变、心脑血管疾病等病症，最终影响患者预后水平[13]。患者在实际生活中，很有可能从蛋白尿的出现到肾功能严重恶化，病程间隔时间较长，目前现有的检测技术不能及时检测患者病情的恶化程度，从而使患者错过最佳治疗时机，而病情如果长期控制不当，最后发展为尿毒症。代谢组学技术的出现为预测患者预后提供了新的思路，此项技术涉及领域广泛，在细胞生物学、组织学等领域均有涉及[14]。其优点在于可定性、定量地鉴定样本的差异代谢物，通过差异代谢物反映疾病预后等关键信息，为临床提供相应的数据支持[15-16]。另外，将T2DN 和代谢组学分析结合预测患者预后的情况，通过比较不同代谢产物的质谱峰，了解不同化合物的结构，找出相应的代谢产物，从而以此建立一套完备且能够用于此类疾病预测的分析方法。目前关于此类研究鲜有报道，对此进行更深入研究具有一定的可行性。而对于代谢产物来说，相应的质谱峰和代谢途径均可以通过代谢组学的方式加以了解，并结合使用可获得的大量数据进行分析。研究认为[17]，T2DN 的发生机制较为复杂，涉及到糖、脂、氨基酸等多种代谢方式、且基因易感化，患者预后水平判别较为困难，代谢组学以其高通量、覆盖面广的优势，成功解决了这一难题[15-16]。具体表现为基因易感化，预后水平判别难的问题均得到有效解决，在实际的操作过程中，差异性代谢物的各变量间相关性较高，而目前运用传统的单变量分析挖掘数据内潜在的信息又不能达到准确和快速的要求。

本研究基于代谢组学，运用多元统计分析方法，可较大程度保留原始信息的基础上将高维复杂的数据进行对研究对象的代谢谱特点进行归纳和总结，并选择P值小于0.05 与VIP 值大于1 作为常见的差异代谢物筛选标准，构建风险预测模型对T2DN患者的预后情况进行预测。此前，基于代谢组学研究，学术界亦有相关报道，赵黎君等[18]提出代谢组学的高通量、覆盖面广的优势，适合类似于糖尿病肾病的研究，可能与患者机体糖、蛋白质及脂质代谢紊乱有关。而本研究中通过代谢组学研究，发现两组的代谢状态可明显区分，代谢产物途径有脂类、氨基酸、糖类代谢，证实了糖尿病肾病与机体内部代谢紊乱有关。同时，王美杰等[19]指出，患者内部存在亚油酸等氨基酸代谢发生改变的可能，而本研究中发现，谷氨酰胺-精氨酸、半乳糖羟赖氨酸均为上调趋势产物，说明血清支链氨基酸水平的升高能预测胰岛素抵抗水平，氨基酸代谢水平异常，胰岛素抵抗严重，上述指标均可对患者的预后加以预测，与王美杰等[19]研究存在相似性。T2DN主要引起微血管病症，代谢组学的引入目的为结合使用临床信息获得的大量数据进行分析，有效证实糖尿病肾病与机体内部代谢间的关联，本研究在代谢组学保留原始信息的基础上将高维复杂的数据进行对研究对象的代谢谱特点进行归纳和总结，筛选出差异性代谢产物，相应氨基酸上调和下降趋势说明机体内部代谢水平异常，能够对患者的预后水平进行有效预测，及时在治疗方法层面做出调整。本研究鉴定出差异性代谢产物中，上调的代谢产物中，溶血磷脂酰胆碱在体内是氧化型低密度脂蛋白的主要活性成分，参与动脉粥样硬化发生发展的各个环节，参与溶血机制的调节，而溶血磷脂酰胆碱上调则表明T2DN 患者血脂调节机制出现异常；谷氨酰胺-精氨酸上调，由于精氨酸是谷氨酰胺的前体，机体内精氨酸可合成谷氨酰胺而更利于人体吸收，T2DN 患者的谷氨酰胺-精氨酸上调说明患者营养物质缺乏较多，导致精氨酸可合成谷氨酰胺过程加快以补充机内因代谢水平异常而缺乏的营养物质；半乳糖羟赖氨酸是由羟基赖氨酸翻译后糖基化产生的骨胶原蛋白，在骨吸收过程中释放，并在代谢性骨丢失中升高，半乳糖羟赖氨酸上调说明代谢性骨丢失过程加强，骨蛋白代谢活动增多，有可能出现代谢水平异常等症状。下调的代谢产物中，溶血磷脂酰乙醇胺在脑组织中居多，与溶血磷脂酰胆碱类似，但是不同的是溶血磷脂酰乙醇胺下调则表示β位脂肪酰基水解脱落异常，从而出现T2DN 的血脂水平下降或上升；磷脂酰胆碱是细胞膜、肺泡表面活性物质、脂蛋白和胆汁的重要成分，对维持肝和脑功能、脂质代谢和运输、细胞膜信号传递、细胞组成和修复都有至关重要的作用。磷脂酰甘油是构成生物膜的主要物质，且是胆汁和膜表面活性物质的主要成分之一，T2DN 患者血脂水平异常很可能由于细胞膜对蛋白质的识别和信号传导阻碍所致，表现在代谢组学上磷脂酰甘油水平下调。鞘磷脂、心磷脂、二酰甘油、TG，神经节苷脂等脂类物质均是主要存在于脑、骨髓、神经组织,以及心、肝、肾等器官中的脂质代谢物，其水平下调可能由于代谢活动过程中脂质水解过程加强，溶酶体中神经磷脂酶催化的水解产物增多，从而使得各种产物在组织内严重堆积，可造成T2DN 的一系列并发症，严重者影响中枢神经系统，甚至危及生命。苯丙胺酰-丙氨酸、透明质酸、磷酸二氢丙酮等物质均参与机体内部糖酵解的过程，准确联络甘油和葡萄糖的间体化学物质，T2DN 患者由于胰岛素抵抗严重，糖酵解途径放缓，导致苯丙胺酰-丙氨酸、透明质酸、磷酸二氢丙酮等中间产物消耗速率加快，表现在代谢组学上为下调趋势。另外，建立预测模型的约登指数衡量了模型预测的真实性，且校准曲线和标准曲线结果无明显偏倚，一致性评价结果良好。本研究的局限性在于对代谢物进行定量分析，深层机理和生化的理解复杂，在确定代谢物结构和功能的过程中，识别力较为分散。

综上所述，基于代谢组学分析构建风险预测模型对预测T2DN 患者预后的情况可明显区分，本研究提出的具有差异性的代谢物均对患者预后有预测价值。