西澳菲斯特农场赤桉蜂蜜对大肠埃希菌腹泻小鼠模型的影响

张雷雷，林韦康

（1.王叔和（郑州）生物制药工程有限公司，河南郑州 450000；2.王叔和生物医药（武汉）有限公司，湖北武汉 430040）

腹泻是全球范围内的公共卫生问题，人群患病范围广，发病率较高，同时在我国卫生疾控方面被列为重点防治的疾病之一[1]。长期研究表明，肠道微生态平衡环境对机体的健康有着重要的影响[2]，机体的肠道疾病也可能与其肠道微生态平衡紊乱有着密切联系[3]。抗生素能够杀死敏感病原菌，但也会破坏机体肠道中菌群环境平衡，甚至影响正常的新陈代谢[4]，进而引发肠道的正常消化功能紊乱和机体免疫力下降，并伴有腹泻等症状[5]。

蜂蜜的使用范围较广。蜂蜜可以通过抗菌性能缓解炎症，还可以修复肠道黏膜，改善肠道微生态，使其达到平衡状态[6-7]。桉树蜜呈深琥珀色，新鲜蜜桉醇味较浓，对跌打损伤、痈肿疮疡及抗感染等有较高的药用价值[8]。

1 材料与方法

1.1 实验药品及试剂

西澳菲斯特农场赤桉蜂蜜（Fewster’s Farm Jarrah Honey，FFJH）；致病性大肠埃希菌；小鼠血管活性肠肽（VIP）ELISA 试剂盒；小鼠胃动素（MTL）ELISA 试剂盒；诺氟沙星。

1.2 实验仪器

XPR 电子分析天平；BX63-CellSens 型全电动智能显微镜；BIO-RAD680 型酶标仪；Wellwash Versa双排全自动洗板机。

1.3 实验动物

C57BL/6小鼠，雄性，SPF级，个体质量（20±2） g，6 ～8 周龄，动物在（23±1）℃的环境中，在相对湿度55%±15%、12 h 的光/暗循环条件下，可以自由取食和饮水。

1.4 实验方法及检测指标

1.4.1 FFJH 对小鼠体重、腹泻率、腹泻指数的影响

实验将C57BL/6 雄性小鼠随机分为9 组，每组15 只，分别为正常组，造模组，诺氟沙星组，市售蜂蜜低剂量组、中剂量组、高剂量组，FFJH 低剂量组、中剂量组、高剂量组。除正常小鼠，其余各组均于腹腔注射0.4 mL 5×108CFU·mL-1的大肠埃希菌溶液，连续给药3 d。造模小鼠出现精神萎靡、活动减少、肛周污秽、便溏，即可视为造模成功。

造模成功后开始给药，正常组市售蜂蜜和模型组市售蜂蜜小鼠给予相同体积的生理盐水，其他各组小鼠可根据实验分组设计给予不同药物，每日给药1 次，给药体积0.4 mL，连续15 d。实验分组情况为诺氟沙星组（0.56 mg·kg-1）、市售蜂蜜低（20%）、中（40%）、高（80%）剂量组和FFJH低（20%）、中（40%）、高（80%）剂量组。给药15 d 后，记录小鼠体重。

依照《药理实验方法学》（第4 版）[9]，分别测定实验第0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d 小鼠腹泻率。观察各组小鼠注射大肠埃希菌后4 h 内的排便情况并记录[10]，并根据实验分组计算腹泻指数，计算公式如下。

腹泻率=腹泻动物数/该组动物总数×100%；腹泻指数=稀便率×平均稀便级。

1.4.2 FFJH 对小鼠小肠推进率的影响

通过注射大肠埃希菌溶液，建立小鼠腹泻模型，计算给定时间内小肠内部的碳末的推进率，以此评判模型小鼠的胃肠蠕动功能水平[11]。小鼠同1.4.1 方法处理，除正常组，在其他小鼠最后一次给药0.5 h后，灌胃0.2 mL 5%碳末悬液。灌胃结束1 h 后，脱颈处死小鼠，打开腹腔，取自幽门至回盲部的肠管部分，放置于托盘上，轻拉成一条直线，小肠总长度通过测量肠管长度得出，计算小肠碳末推进率。

1.4.3 FFJH 对小鼠血清胃肠激素的影响

给药周期结束后，小鼠在禁食12 h，通过摘去眼球取血，静置1.5 h，以3 000 r·min-1离心10 min，分离血清于-20 ℃冰箱留存。根据ELISA 试剂盒的相关说明书测定胃动素（Motilin，MTL）、血管活性肠肽（Vasoactine Intrestinal Peptide，VIP）含量。

2 结果与分析

2.1 FFJH 对大肠埃希菌腹泻小鼠模型小鼠体重的影响

FFJH 对大肠埃希菌腹泻小鼠模型小鼠体重的影响如图1 所示。模型组小鼠注射大肠埃希菌之后，进食量、饮水量均减少，精神萎靡，被毛散乱无光泽，肛周毛发被稀便污染，实验结束后小鼠体重较正常组显著降低（P＜0.01），出现了明显的腹泻现象。相比模型组，FFJH 低、中、高剂量组小鼠饮食及活动显著增加（P＜0.01），精神状态好转，肛周毛发较干净，腹泻症状减轻。这些结果表明FFJH 对大肠埃希菌腹泻小鼠具有一定的修复作用。

图1 不同试验组小鼠体重情况

2.2 FFJH 对小鼠腹泻率和腹泻指数的影响

2.2.1 FFJH 对小鼠腹泻率的影响

造模小鼠3 d 后开始出现活动减少、精神萎靡、肛周污秽、便溏的现象。模型组，诺氟沙星组，市售蜂蜜中、高剂量组，FFJH 低、中、高剂量组腹泻率均为100%，市售蜂蜜低剂量组腹泻率为90%，认为塑造大肠杆菌腹泻小鼠模型成功。实验第5 d，模型组小鼠腹泻率为80%，市售蜂蜜低、中、高剂量组小鼠腹泻率为80%，FFJH 低剂量组小鼠腹泻率均为80%，FFJH 中、高剂量组小鼠腹泻率为70%。实验第9 d，各给药组小鼠情况逐渐好转，仅有市售蜂蜜低剂量组和模型组小鼠存在腹泻现象，其精神仍旧萎靡，活动较少。

2.2.2 FFJH 对小鼠腹泻指数的影响

由图2 可知，相对于正常组，模型组小鼠的腹泻指数显著增加（P＜0.01），说明造模成功。相对于模型组，诺氟沙星组，市售蜂蜜高剂量组，FFJH低、中、高剂量组小鼠的腹泻指数均有显著减少（P＜0.01）。

图2 各组小鼠腹泻指数图

2.3 FFJH 对小鼠小肠推进率的影响

由图3 可知，与正常组相比，模型组碳末推进率显著增高（P＜0.01），说明腹泻模型制备成功。与模型组相比，诺氟沙星组，FFJH 低、中、高剂量可显著降低模型小鼠的小肠推进率（P＜0.01），说明FFJH 在腹泻条件下能显著改善鼠肠道环境。

图3 各组小鼠小肠推进率

2.4 FFJH 对小鼠血清胃肠激素的影响

由图4 可知，与正常组相比，模型组小鼠的血清MTL 含量出现显著降低，VIP 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，FFJH 中剂量组MTL含量明显升高（P＜0.05），FFJH 高剂量组MTL 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，诺氟沙星组、FFJH 中剂量组和FFJH 高剂量组显著降低了小鼠血清VIP 含量（P＜0.01），市售蜂蜜低、中、高剂量组和FFJH 低剂量组可明显降低小鼠血清VIP 含量（P＜0.05），提示FFJH 具有一定改善消化道环境的作用。

图4 各组小鼠胃动素、血管活性肠肽含量

3 结论与讨论

综上所述，本试验采用注射大肠埃希菌溶液，采用大肠埃希菌注射塑造相关性腹泻小鼠模型，通过测定各组小鼠体质量、腹泻率和腹泻指数、小肠推进率和血清胃肠激素含量，发现FFJH 可以改善大肠杆菌所致腹泻小鼠的体重、腹泻率及血清胃肠激素等相关指标，对机体有一定的修复作用。本研究也存在一定不足之处，实验虽然证明了FFJH 可以通过其专用特性及改善肠道微生态能够改善腹泻，却并未对肠道微生态调节相关的具体的发生机制进一步探究。