栀子与早期肠内营养对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障的保护作用

聂永春 苏晓芳 李明月 王庆华

Abstract  Objective：To explore the protective effect of gardenia jasminoides ellis and early enteral nutrition on intestinal mucosal barrier function in rats with severe acute pancreatic.Methods：90 SD rats were randomly divided into control check group，severe acute pancreatitis group，gardenia jasminoides ellis group，early enteral nutrition group，and gardenia jasminoides ellis and early enteral nutrition group，with 18 rats in each group.Gardenia jasminoides ellis group，gardenia jasminoides ellis and early enteral nutrition group were given gardenia jasminoides ellis extract（1 mL/100 g） by gavage immediately，9 h，21 h and 33 h after the model woke up.Early enteral nutrition group， gardenia jasminoides ellis and early enteral nutrition group were evenly injected with enteral nutrition solution（1 mL/100 g） through the jejunostomy tube 12 h after the model was established，and once every 1.5 h，15 min each time.Control check group and severe acute pancreatitis group were given 0.9% sodium chloride solution at the same time by the same way as above.Six rats were sacrificed at 12 h，24 h and 36 h after modeling，respectively.The serum amylase（AMY） and Ca2+concentrations of rats in were detected by automatic biochemical analyzer.Hematoxylin?eosin（HE） staining was used to observe the pathological changes of intestinal tissues of rats in each group，and the corresponding pathological scores were determined.Wet/Dry weight ratio（W/D） was used to detect the degree of intestinal tissue swelling in each group.The changes of DAO，TNF?α，HO?1 and IL?10 in serum were detected by enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：With the prolongation of time （12 h，24 h，36 h），compared with severe acute pancreatitis group，the injury degree of intestinal mucosal tissue was lower，pathological score，W/D mass of intestinal mucosa，serum AMY and serum DAO concentration in early enteral nutrition group，gardenia jasminoides ellis group and early enteral nutrition and gardenia jasminoides ellis group were decreased（P<0.05），and serum Ca2+concentration was increased（P<0.05）.Compared with the early enteral nutrition group and gardenia jasminoides ellis group，the serum Ca2+concentration of gardenia jasminoides ellis and early enteral nutrition group increased，and the injury degree of the intestinal mucosal tissue was lower，pathological score，W/D mass of intestinal mucosa，serum DAO concentration decreased（P<0.05）.With the prolongation of time（12 h，24 h，36 h），compared with severe acute pancreatitis group，the concentrations of serum TNF?α in early enteral nutrition group，gardenia jasminoides ellis group and early enteral nutrition and gardenia jasminoides ellis group were lower，while the concentrations of serum HO?1 and IL?10 were higher（P<0.05）.Compared with early enteral nutrition group and gardenia jasminoides ellis group，the concentrations of serum HO?1 and IL?10 in early enteral nutrition and gardenia jasminoides ellis group increased，and serum TNF?α decreased（P<0.05）.Conclusion：Gardenia jasminoides ellis and early enteral nutrition had protective effects on intestinal mucosal barrier injury in rats with severe acute pancreatitis，mainly through upregulating anti?inflammatory factors IL?10，HO?1，and down?regulating pro?inflammatory factor TNF?α to reduces the damage of inflammatory reaction to intestinal mucosal barrier.

Keywords  gardenia jasminoides ellis； early enteral nutrition； severe acute pancreatitis； intestinal mucosal barrier； rat

摘要  目的：探讨栀子与早期肠内营养对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠黏膜的保护作用。方法：将90只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、重症急性胰腺炎模型组、栀子组、早期肠内营养组及栀子与早期肠内营养组，每组18只。栀子组、栀子与早期肠内营养组大鼠于造模苏醒后即刻、9 h、21 h、33 h给予栀子提取液（1 mL/100 g）灌胃，早期肠内营养组、栀子与早期肠内营养组于造模后12 h经空肠造瘘管均匀注入肠内营养液（百普素，1 mL/100 g），每隔1.5 h给予1次肠内营养液，每次15 min。空白对照组和重症急性胰腺炎模型组按上述相同方式同时给予0.9%氯化钠溶液。分别于造模后12 h、24 h、36 h处死6只大鼠并进行取材，检测各组大鼠血清淀粉酶（AMY）、血清钙离子（Ca2+）的浓度变化；苏木精?伊红（HE）染色观察各组大鼠肠组织病理变化并进行相应病理评分；使用肠湿干质量之比（W/D）检测各组大鼠肠组织肿胀程度；使用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠血清二胺氧化酶（DAO）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、血红素氧合酶1（HO?1）以及白介素?10（IL?10）浓度。结果：随着时间变化（12 h、24 h、36 h），与重症急性胰腺炎模型组比较，早期肠内营养组、栀子组、栀子与早期肠内营养组大鼠肠黏膜组织损伤程度、病理评分、肠黏膜组织W/D质量、血清AMY、血清DAO浓度降低（P<0.05），血清Ca2+浓度升高（P<0.05）。与早期肠内营养组、栀子组比较，栀子与早期肠内营养组血清Ca2+浓度升高，大鼠肠黏膜组织损伤程度、病理评分、肠黏膜组织W/D、血清AMY、血清DAO浓度降低（P<0.05）。随着时间的（12 h、24 h、36 h）延长，与重症急性胰腺炎模型组比较，早期肠内营养组、栀子组、栀子与早期肠内营养组大鼠血清TNF?α浓度降低，血清HO?1、IL?10浓度升高（P<0.05）。与早期肠内营养组、栀子组比较，栀子与早期肠内营养组血清HO?1、IL?10浓度升高，血清TNF?α浓度降低（P<0.05）。结论：栀子与早期肠内营养对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障损伤有保护作用，主要是通过上调血清抗炎因子IL?10、HO?1浓度，下调血清促炎因子TNF?α浓度减轻炎症反应对肠黏膜屏障的损伤。

关键词  栀子；早期肠内营养；重症急性胰腺炎；肠黏膜屏障；大鼠

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2023.08.007

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatic，SAP）是消化系统急危重症疾病，肠道是应激反应中心和最先受损伤的器官，重症急性胰腺炎常继发肠黏膜屏障功能障碍[1]。肠道内的细菌和毒素移位至肠道相关淋巴结，并经血液循环抵达全身，加重炎症反应，甚至诱发多器官衰竭（multiple organ failure，MOF），加快重症急性胰腺炎病人病情进展[2]。重症急性胰腺炎病人中因肠道细菌移位引发并发症造成死亡例数为其死亡总例数的4/5。近年来，中医与西医联合应用的整体治疗在重症急性胰腺炎病人肠屏障损伤治疗中的优势不断显现，已成为重症急性胰腺炎病人肠屏障损伤治疗的重要方式[3]。早期肠内营养可减轻肠黏膜屏障损伤。栀子属于临床上常用的药食同源中药材，含京尼平苷、西红花苷、都桷子苷等多种成分，在免疫调节、保肝利胆、降糖调脂、抗炎、抗氧化应激等多方面发挥作用[4]。基础实验发现，栀子对肠黏膜屏障具有保护作用，但目前栀子与早期肠内营养对重症急性胰腺炎病人肠黏膜屏障功能的作用及两者是否发挥协同作用尚不清楚[5?6]。因此，本研究将栀子与早期肠内营养联合，探讨其对重症急性胰腺炎病人肠黏膜屏障的保护作用，以期为临床治疗提供实验依据。

1  材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取90只雄性清洁级SD大鼠，体质量220～260 g，购自济南朋悦动物实验繁殖有限责任公司，实验动物许可证码：SCXK（鲁）20190007，于某医学院清洁级动物房饲养。所有实验设计遵循某医学院实验动物使用指南并经医学伦理委员会批准（伦理编号：2020?81）。采用随机数字表法将90只SD大鼠分为空白对照组、重症急性胰腺炎模型组、早期肠内营养组、栀子组、栀子与早期肠内营养组，每组18只大鼠。

1.2 药物及主要实验试剂 百普素（生产厂家：Milupa GmbH，德国）；栀子（生产厂家：亳州仁益药材有限公司）；牛磺胆酸钠（购自美国Sigma公司）；大鼠血清二胺氧化酶（DAO）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、血红素氧合酶1（HO?1）以及白介素?10（IL?10）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（购自上海酶联生物科技有限公司）；苏木精?伊红（HE）染液（购自北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 动物模型制备 根据Aho等[7]提出的重症急性胰腺炎造模方式复制模型，操作方法如下：①用10%水合氯醛0.3 mL（100 g）麻醉SD大鼠。②75%乙醇打湿SD大鼠腹部毛发并修剪，沿大鼠腹白线切割直至白膜后改用剪刀轻轻划开，铺无菌纱布，血管钳夹住腹腔两侧的皮肤，于肝脏下稍左上位置可观察到粉色的组织，周围被十二指肠包绕，即为胰腺组织。③将十二指肠提取并稍微抬高，用无菌动脉夹夹住靠近肝脏端的胰胆管，将3.8%牛磺胆酸钠0.1 mL（100 g）溶液用26G静脉留置针沿十二指肠周围无血管的部位缓慢注入胆胰管（0.06 mL/min），并用无菌纱布覆盖腹腔，注射完毕5 min后，胰腺组织明显充血且呈深色。与造模前有明显的差距，说明模型初步成功。④取出静脉留置针，并轻轻地用浸湿的棉签按压出血部位，松开靠近肝脏位置的动脉夹，将胰腺、肠组织尽量恢复到解剖位置，逐层缝合，将0.9%氯化钠溶液经后颈部皮下注入大鼠体内。⑤将大鼠复温并置于鼠笼中饲养，只需限制饮食。空白对照组造模方式与重症急性胰腺炎模型组相似，仅需将3.8%牛磺胆酸钠换成0.9%氯化钠溶液。

1.4 药物制备及给药方法

1.4.1 药物制备 ①栀子制备：将栀子与75%的乙醇按照1∶10的比例混匀，静置12 h，回收滤液，重复2次，将回收的滤液放于蒸馏瓶中进行加热，当滤液变成黏糊状时停止操作。利用减压操作技术获得栀子浸膏，放置于-80 ℃冰箱中冷藏備用。将栀子浸膏溶于生理盐水中，最终获得0.5 g/mL的栀子（已转换成生药的含量）。②百普素肠内营养液制备：将Milupa GmbH生产的含有多种成分的每袋125 g的百普素粉末（生产批号：H20100287）溶于50 mL温水中，充分搅拌混匀，然后再加入温水定容至500 mL。

1.4.2 给药方法 栀子组、栀子与早期肠内营养组大鼠于造模苏醒后即刻、9 h、21 h、33 h给予栀子提取液1 mL（100 g）灌胃，早期肠内营养组、栀子与早期肠内营养组于造模后12 h经空肠造瘘管均匀注入肠内营养液（百普素，1 mL/100 g），每隔1.5 h给予1次肠内营养液4 mL，每次15 min，循序渐进加至每天62.5 mL，每天每只大鼠需供能25 kcal（100 g）。空白对照组、重症急性胰腺炎模型组经上述相同方式给予0.9%氯化钠溶液。

1.5 标本采集 各组均于造模后12 h、24 h、36 h各取6只大鼠采腹主动脉血后处死，收集上层血液用于血清学指标的检测。留取胰腺和回肠组织，清除周围的血渍和黏连的组织，用于HE染色、肠组织湿/干质量（W/D）的检测。

1.5.1 血清学指标的检测 大鼠腹主动脉采血5～8 mL，血液标本采集后在常温下静置30 min以上，于离心机（4 ℃）中按3 500 r/min，离心25 min，收集上清。依据ELISA试剂盒的说明书测定血清DAO、TNF?α、HO?1、IL?10的表达水平。全自动生化仪测定血清淀粉酶（AMY）以及钙离子（Ca2+）浓度。

1.5.2 回肠组织病理观察 大鼠处死后，将距回盲部2 cm处回肠组织（肠组织保持空虚状态）于4%多聚甲醛中固定24～48 h，脱水包埋切片，进行HE染色，在光镜下按照Chiu等[8]6级评分法进行形态学观察，并采用双盲法，由专业的病理师对其进行评分。

1.5.3 肠组织W/D 用磷酸盐缓冲液将距回盲部远端5 cm的回肠组织冲洗干净，去除残余的血渍及周围黏连组织，将多余的水分用滤纸吸净，于精密称量仪上测得湿质量。放于65 ℃烘箱48 h进行烘干后测得干质量。通过W/D×100%计算组织肿胀度。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0数据分析软件对所得数据进行统计学分析。符合正态分布的定量资料采用均数±标准差（x±s）进行描述，组间比较采用重复测量方差分析，组内比较采用单因素方差分析。定性资料以只数、百分比（%）表示，行χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 大鼠回肠组织HE染色结果 重症急性胰腺炎模型组：大鼠肠黏膜组织形态不完整，绒毛顶端破损，上皮下的间隙增宽，与固有层分离明显并伴炎性细胞浸润，随时间延长病理损伤逐渐加重。空白对照组：大鼠肠黏膜组织结构比较清晰、完整。早期肠内营养组、栀子组、栀子与早期肠内营养组上述变化明显改善，且栀子与早期肠内营养组肠黏膜组织病理损伤程度低于栀子组以及早期肠内营养组。详见图1。

2.2 各组大鼠血清AMY、Ca2+浓度变化 大鼠血清AMY、Ca2+重复测量方差分析结果显示，时间与组间交互作用显著，差异均有统计学意义（P<0.05），表明经不同干预措施处理的SD大鼠血清AMY、Ca2+浓度随时间（12 h、24 h、36 h）的延长变化幅度不同，栀子与早期肠内营养组大鼠血清Ca2+浓度高于重症急性胰腺炎模型组、早期肠内营养组、栀子组；血清AMY浓度低于重症急性胰腺炎模型组、早期肠内营养组、栀子与早期肠内营养组，差异均有统计学意义（P<0.05），详见表1。

2.3 各组大鼠肠黏膜组织病理评分、W/D、血清DAO浓度比较 大鼠肠黏膜组织病理评分、W/D、DAO浓度经重复测量方差分析结果显示，时间与组间交互作用显著，差异均有统计学意义（P<0.05），表明经不同干预措施处理的SD大鼠肠黏膜组织病理评分、W/D、血清DAO浓度随时间（12 h、24 h、36 h）的延长变化幅度不同，栀子与早期肠内营养组大鼠上述指标低于重症急性胰腺炎模型组、早期肠内营养组、栀子组，差异均有统计学意义（P<0.05），详见表2。

2.4 各组大鼠血清炎性因子变化 大鼠血清TNF?α、HO?1、IL?10经重复测量方差分析结果显示，时间与组间交互作用显著，差异均有统计学意义（P<0.05），表明经不同干预措施处理的SD大鼠TNF?α、HO?1、IL?10浓度随时间（12 h、24 h、36 h）的延长变化幅度不同，栀子与早期肠内营养组大鼠血清HO?1、IL?10浓度高于重症急性胰腺炎模型组、早期肠内营养组、栀子组，TNF?α浓度低于重症急性胰腺炎模型组、早期肠内营养组、栀子与早期肠内营养组，差异均有统计学意义（P<0.05），详见表3。

3  讨论

重症急性胰腺炎伴发肠黏膜屏障损伤常与炎症因子“无节制”地释放、肠腔营养物的缺乏以及肠组织缺血、缺氧等发病机制有关[9]。目前，关于重症急性胰腺炎肠黏膜屏障损伤的治疗方式众多，但都缺乏较有效的干预方式。Pan等[10]通过大鼠软骨细胞体外实验发现，栀子通过抑制磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核转录因子κβ（NF?κβ）信号通路对骨关节炎起到治疗作用。莫霏霏等[11]基于溃疡性结肠炎大鼠模型发现，栀子苷通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/肌球蛋白轻链激酶（MLCK）信号通路下调炎性因子表达发挥屏障保护作用。蔡雪军等[12]发现，早期肠内营养通过降低降钙素原（PCT）、C?反应蛋白（CRP）、白细胞（WBC）表达水平减轻重症急性胰腺炎病人肠源性感染。基于栀子抑制炎症反应以及早期肠内营养对肠黏膜屏障损伤发挥的积极作用，本研究推断栀子与早期肠内营养对重症急性胰腺炎肠黏膜屏障的损伤均具有治疗作用。

胰蛋白酶过度激活以及Ca2+超载学说是最早探讨重症急性胰腺炎致病过程的2条途径，常引发血清AMY浓度增高、血清Ca2+浓度降低。本研究结果显示，重症急性胰腺炎模型组大鼠血清AMY浓度较空白对照组升高（P<0.05），血清Ca2+浓度降低（P<0.05），表明重癥急性胰腺炎模型复制成功。DAO属于肠黏膜屏障损伤和完整性的标志物。正常情况下，血液中不含DAO，当肠组织发生损伤时，肠组织中DAO释放到血液中，引起血清DAO浓度增高。血清DAO浓度的变化与肠组织病理损伤评分、肠黏膜屏障的完整性呈正相关[13]。本研究结果显示，重症急性胰腺炎模型组大鼠血DAO浓度、肠组织病理损伤评分以及肠组织W/D均较空白对照组升高（P<0.05），表明重症急性胰腺炎伴发肠黏膜屏障损伤模型复制成功。通过给予重症急性胰腺炎大鼠实施早期肠内营养、栀子、栀子与早期肠内营养干预，结果显示，与早期肠内营养组和栀子组比较，栀子与早期肠内营养组血清Ca2+浓度升高，血清AMY浓度降低（P<0.05），表明栀子与早期肠内营养具有改善重症急性胰腺炎肠黏膜屏障损伤的作用。首先，栀子中京尼平苷具有降胰淀粉酶的生物特性，能够抑制胰淀粉酶通过静脉进入到血液中，发挥减轻血清淀粉酶浓度的作用[14]。其次，栀子具有降低环核苷酸浓度，提升Ca2+?Mg2+?三磷酸腺苷酶（ATP）生物活性，从而增加血清Ca2+浓度的作用，与王磊[15]的研究结果相似，其研究发现，栀子可通过增加超氧化物歧化酶浓度、减轻线粒体膜损伤、抑制氧自由基的释放发挥减轻肠黏膜屏障损伤，与Cui等[16]的研究结果亦相似。另外，早期肠内营养不仅具有增强重症急性胰腺炎大鼠肠蠕动、维持肠道菌群平衡、降低肠源性感染风险的作用，还具有促进肠腔吸收营养物质、刺激肠黏膜、减轻肠萎缩的功能，对重症急性胰腺炎肠黏膜屏障损伤发挥保护作用[17?18]，与Zhang等[19]的研究结果相似。因此，栀子与早期肠内营养组肠黏膜组织病理评分、W/D、血清DAO浓度降低。本研究结果在一定程度上表明早期肠内营养与栀子联合应用改善肠黏膜屏障损伤的功效优于单独应用早期肠内营养或栀子。

炎症因子“无节制”地释放在重症急性胰腺炎病人肠黏膜屏障功能障碍中发挥重要的作用，对肠黏膜屏障损伤起“助燃剂”的作用[20]。首先，在重症急性胰腺炎起始阶段，损伤或坏死的胰腺组织激活免疫细胞中的单核巨噬细胞系统，促使中性粒细胞活化、氧自由基以及TNF?α、IL?6等炎性因子相继无限释放，机体IL?10、HO?1等抗炎因子无法与之匹敌，造成全身炎症反应综合征（SIRS），继发肠黏膜屏障损伤[21]。其次，肠黏膜在其他不利因素（肠腔内营养物质匮乏）刺激下激活肠道相关淋巴组织，释放IL?8、IL?1β等促炎因子，对肠黏膜屏障造成损伤，促使重症急性胰腺炎大鼠血清中炎症因子增多[22]。研究发现，在炎症因子风暴中，TNF?α是一种多效应性的炎症因子，在重症急性胰腺炎由局限性炎症反应进展为全身炎症反应综合征甚至多器官功能衰竭（MOF）的过程中发挥“阀门”作用，能够激活并释放多种促炎因子，影响重症急性胰腺炎病人的病情和预后[23]。IL?10最初为Th2细胞分泌的多功能炎症因子，在细胞生长与分化、炎症介质与免疫调节方面发挥着重要作用[24]，具有拮抗TNF?α、IL?8等炎症因子释放的功效，并能较好地预测重症急性胰腺炎病人病情的严重程度[25]。HO?1是具有多种功能作用的保护酶，HO?1基因过表达能够减轻氧化损伤以及炎症反应。研究发现，重症急性胰腺炎早期，HO?1蛋白在炎症刺激下过度表达通过显著增加血清IL?10浓度、降低TNF?α浓度，对肾脏等组织损伤发挥保护作用[26]。本研究结果显示，重症急性胰腺炎模型组TNF?α、HO?1、IL?10浓度比空白对照组高（P<0.05），表明炎症因子风暴参与了重症急性胰腺炎肠黏膜屏障的损伤。给予重症急性胰腺炎大鼠实施早期肠内营养、栀子、早期肠内营养与栀子后，与早期肠内营养组、栀子组比较，栀子与早期肠内营养组大鼠血清HO?1、IL?10浓度升高（P<0.05），血清TNF?α浓度降低（P<0.05），表明栀子与早期肠内营养具有降低炎症反应的作用，且作用效果优于单独应用早期肠内营养或者栀子。主要原因可能为：首先，栀子中含有的有效成分栀子苷具有抗炎作用，可减轻促炎因子的释放。张清平等[27]研究表明，栀子的有效成分栀子苷能够抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎性小体的激活，降低下游炎性因子IL?18以及IL?1β的生成和释放。其次，栀子能够促进有益菌群（双歧杆菌、乳酸杆菌）的繁殖以及抑制有害菌群（肠杆菌、肠球菌）的生长，从而发挥调控肠道菌群稳态的功效，减轻炎症因子对肠黏膜屏障损伤[28]。最后，早期肠内营养具有改善肠黏膜病理损伤、增强免疫功能、降低菌群以及内毒素易位的作用，发挥屏障保护功能，降低炎症因子对肠黏膜屏障的侵袭。本研究结果也在一定程度上证明了早期肠内营养与栀子具有协同作用，共同发挥减轻抗炎功效。

4  小结

综上所述，栀子与早期肠内营养通过上调血清HO?1、IL?10浓度及下调血清TNF?α浓度发挥抗炎作用，减轻炎症反应对肠黏膜屏障的损伤，为重症急性胰腺炎伴肠黏膜屏障损伤病人的治疗提供一定的借鉴。

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（收稿日期：2022-05-10；修回日期：2023-03-20）

（本文編辑 曹妍）