Hippo/MST1 对老龄围术期小鼠认知功能的影响及机制

展巧稚， 阎文军，2

（1. 宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.甘肃省人民医院麻醉科，兰州 730000）

围术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive disorders，PND）是手术和麻醉过程中常发生的中枢神经系统并发症。在老年人群（＞60 岁）中患病率增加。PND 可以影响不同的认知领域，如语言记忆、语言理解、视觉记忆、注意力和执行功能[1]，最明显的主观症状是记忆能力缺陷和执行能力下降[2]。PND 通常是自限性的，但它可以持续数月甚至数年，甚至可能变成永久性疾病。目前对PND 的发病机制尚不清楚。由手术创伤引起的外周炎症和全身的释放会影响中枢神经系统的炎症过程[3]，并且其水平的高低与认知功能障碍的严重程度相关，尤其是在记忆和学习方面[4-5]。

哺乳动物系不育20 样激酶 1（mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1），属于Ste-20 家族的Ⅱ类GC 激酶，MST1 基因位于人类染色体20q11。MST1 是Hippo 信号通路中的主要成员，通过调节细胞增殖和分化来调节生物大小[6]。细胞高表达MST1 在细胞凋亡以及促进潜在的炎性反应中起重要作用[7-8]。反之，当细胞中缺乏MST1 则会抑制促炎性细胞因子产生[9]。因此，MST1被认为是神经炎症的重要正性调节剂。但其在围术期神经认知障碍中的作用还未见相关研究报道。本研究通过观察老龄PND 小鼠术后各个时间点Hippo 通路关键分子MST1、P-MST1 的表达情况，探讨调控Hippo/MST1 信号通路对老龄PND 小鼠学习记忆障碍以及神经炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验所使用SPF 级健康雄性C57BL/6J 小鼠均来自斯贝福（北京）生物技术有限公司，14月龄，体质量35～45 g。在动物饲养过程中维持室温25 ℃左右，湿度50%左右，12 h/12 h 的白天/夜间生活环境，给予足够的水和食物，定期更换饲料，保证动物生活环境干净和清洁。实验动物许可证号：SCXK（京）2019-0010。

1.2 药品与试剂

XMU-MP-1（MST1 抑制剂，批号：M00051，规格：5 mg，上海蓝木化工有限公司）；anti-MST1（货号：22245-1-AP，武汉Proteintech 公司）、antip-MST1（Thr183，型号：49332，美国CST 公司）、GAPDH（货号：10494-1-AP，武汉Proteintech 公司）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（货号：SA00001-2，武汉Proteintech 公司）；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒、小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）检测试剂盒（货号：EMC102a.96、EMC001b.96，上海欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验方案 1）实验第一部分：验证模型的成功及术后MST1、P-MST1 的表达。对48 只健康雄性老龄C57BL/6J 小鼠在实验开始前进行水迷宫定位航行训练，一方面为了使老龄小鼠学会寻找隐藏在水下的平台，另一方面为了剔除学习记忆能力异常的小鼠。每只小鼠于固定时间点重复训练6 d，若小鼠连续6 d 在60 s 内不能找平台，则视为认知功能异常并剔除。选取学习记忆能力正常的小鼠随机分为假手术组（Sham 组）和手术组（PND 组），每个时间点各6 只。Sham 组小鼠麻醉后于右侧后肢胫前皮肤仅给予切开缝合处理；PND 组小鼠在麻醉后接受胫骨骨折髓内钉固定术处理。在术前连续6 d 对小鼠进行水迷宫定位航行训练，于第7 天做胫骨骨折髓内钉固定手术建立PND 模型，空间探索实验分别在术后1、5、7、14 d 进行，各个时间点水迷宫结束后立即将动物处死，取海马组织，Western blot 检测MST1、P-MST1 的表达。2）实验第二部分：同第一部分，实验前对40 只健康雄性C57BL/6J 小鼠行水迷宫定位航行训练后选取学习记忆能力正常的小鼠随机分为Sham 组、PND 组、PND+Vehicle 组和PND+XMU-MP-1 组，每组10 只。Sham 小鼠仅给予麻醉后切开缝合处理；PND 组小鼠在麻醉后接受胫骨骨折髓内钉固定术。根据文献[10]配制XMUMP-1 溶液，其腹腔注射溶剂配方：将XMU-MP-1溶解在纯的DMSO 中配成母液，母液浓度为100 mg·mL-1，然后按照体积比加入其他溶剂。配方：2% 母 液（in DMSO）+30% PEG300 +2%Tween80+66%水，工作液浓度为2 mg·mL-1。储存：母液可以分装冻存（-80 ℃），工作液现配现用。PND+XMU-MP-1 组于麻醉前半小时和苏醒后腹腔注射XMU-MP-1 2 mg·kg-1，每日1 次，连续7 d，PND+Vehicle 组每天腹腔注射相同体积的溶剂。各组小鼠于术后第7 天空间探索实验结束后立即处死，提取双侧海马进行检测。

1.3.2 采用胫骨骨折髓内钉固定术建立小鼠PND 模型[11]5%水合氯醛（药物用量0.5 mL/100 g）麻醉小鼠，待小鼠失去感觉后进行手术治疗，小鼠仰卧位于手术台上，备皮，使用碘伏棉签对其右侧后肢胫前皮肤部位以及周围1 cm 处的皮肤进行消毒，切开皮肤约0.50 cm，分离皮下组织暴露小鼠的胫骨，取宽0.38 mm、长0.80 cm 的钢针插入小鼠髓腔中，用眼科剪于胫骨中下1/3 处剪断，术后冲洗伤口并缝合。术后在切口周围局部浸润镇痛，术中注意保持小鼠在合适的体温，等小鼠苏醒良好放回笼内饲养。术后对各组老龄小鼠行水迷宫空间探索实验，提取数据分析老龄小鼠认知功能状态，其中逃避潜伏期越长、穿台次数越少、目标象限停留时间百分比越低，表示老龄小鼠学习记忆障碍越严重，则表明PND 模型建立成功。

1.3.3 小鼠水迷宫行为学测定[12]本实验利用Morris 水迷宫实验对小鼠的空间学习、记忆等认知水平进行评估。具体内容包括：1）定位航行实验：实验前先将老龄小鼠放置在平台上停留30 s，待其熟悉周围环境后，将小鼠头朝池壁放入水中，记录小鼠找到水下隐藏平台的时间，连续训练6 d。剔除在规定时间内找不到水下隐藏平台的小鼠，将所有在规定时间内能找到水下平台的老龄小鼠集中，随机分为Sham 组和PND 组。于第7 天做胫骨骨折髓内钉固定手术建立PND 模型，分别于术后1、5、7、14 d 进行空间探索实验。2）在经过连续6 d 的训练后，老龄小鼠已形成固定的记忆，当撤除水下隐藏平台，小鼠会凭已经形成的记忆探索原来的平台，在平台所在位置停留时间会比其他任何位置多。将老年小鼠由原始平台所在位置的对侧象限头朝下放入水中，记录并分析老龄小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间百分比、穿台次数和游泳速度，作为检测空间记忆的指标。

1.3.4 Western blot 测定小鼠海马组织MST1、PMST1 表达 提取海马组织，根据BCA 法检测总蛋白含量，然后采用浓缩胶80 V、30 min，分离胶120 V、90 min 的条件分离，在转完膜后用含5%脱脂牛奶的封闭液封闭2 h，将活化的PVDF 膜与anti-P-MST1（1∶1 000）、anti-MST1（1∶1 000）、anti-GAPDH（1∶4 000 稀释）在4 ℃下孵育过夜，之后加HRP 偶联二抗（1∶2 000）在室温下孵育1 h。采用超敏ECL 发光液进行显影，采用Image J软件计算P-MST1 的相对蛋白表达水平（P-MST1/MST1），用GraphPad 绘制柱状图。

1.3.5 ELISA 检测小鼠海马组织IL-1β、TNF-α水平 根据试剂盒说明书，将海马样品制备成组织匀浆，离心（10 000 r·min-1，15 min）后去除悬浮物，收集上清液用ELISA 法检测海马组织IL-1β、TNF-α 的表达。使用96 孔板在450 nm 处测量吸光度，将所有用标准品和样品的吸光值减去对照值后建立坐标和方程，计算出的浓度乘以稀释倍数为最终浓度。用该浓度除以蛋白浓度即得到最终结果（以pg·mg-1protein 表示）。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，定位航行实验数据采用重复测量方差分析，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 老龄PND 小鼠水迷宫试验结果及其海马组织P-MST1 的表达

与Sham 组相比，在术后1、5、7 d PND 组小鼠的潜伏期延长，小鼠在目标象限停留的时间百分比缩短，穿台次数减少（P均＜0.01），见图1a～图1c，表明模型制作成功。胫骨骨折内固定术后14 d，老年小鼠到达平台的逃避潜伏期、目标象限停留时间百分比，穿台次数基本恢复正常水平。胫骨骨折术后老年小鼠的游泳速度无变化（P均＞0.05），见图1 d。Western blot 结果显示，与Sham组比较，术后1、5、7、14 d 老年PND 小鼠海马区P-MST1 表达均升高（P均＜0.01），术后第7 天P-MST1 达峰值，术后第14 天P-MST1 表达较第7 天下降，与Sham 组比较MST1 总蛋白的表达无变化（P＞0.05），见图2。

图1 老龄PND 小鼠水迷宫空间探索实验结果

图2 Western blot 检测老龄PND 小鼠海马组织P-MST1 的动态表达

2.2 老龄PND 小鼠腹腔注射XMU-MP-1 对水迷宫试验结果及其海马组织P-MST1 表达的影响

第一部分实验结果表明，老年PND 小鼠海马组织P-MST1 在术后第7 天升高更为明显，因此第二部分实验选择术后第7 天的时间点进行研究。各组小鼠在手术后第7 天的水迷宫空间探索结果显示，与Sham 组相比，PND 组小鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间百分比降低，穿台次数减少（P均＜0.05）。与PND 组比较，PND+XMU-MP-1 组小鼠逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间百分比延长，穿台次数增加（P均＜0.05），见图3。

图3 老龄PND 小鼠腹腔注射XMU-MP-1 水迷宫空间探索实验结果

2.3 老龄PND 小鼠腹腔注射XMU-MP-1 对海马组织P-MST1 蛋白表达的影响

与Sham 组比较，PND 组P-MST1 蛋白表达升高（P＜0.05）。与PND 组比较，PND+ XMU-MP-1治疗组P-MST1 的蛋白表达降低（P＜0.05），见图4。

2.4 腹腔注射XMU-MP-1 对老龄PND 小鼠海马组织TNF-α、IL-1β 表达的影响

与Sham 组相比，术后第7 天老龄PND 组小鼠海马组织匀浆液中TNF-α、IL-1β 水平升高（P均＜0.05）。与PND 组相比，PND+XMU-MP-1 治疗组老龄PND 小鼠海马组织TNF-α、IL-1β 的表达水平降低（P均＜0.05），见图5。

图5 ELISA 检测XMU-MP-1 对老龄PND 小鼠海马组织TNF-α、IL-1β 表达的影响

3 讨论

本研究首次探索了老年PND 小鼠脑海马组织中Hippo 信号通路中关键成分MST1 蛋白激活对小鼠学习和记忆的影响，运用MST1 抑制剂XMU-MP-1 干预老年PND 小鼠，观察其学习和记忆功能的变化以及与记忆功能密切相关的海马组织中炎性因子水平的变化。结果表明，老年PND 小鼠海马依赖性记忆受损，术后XMU-MP-1 干预减轻了手术导致的记忆障碍，减少了促炎因子的释放，提示XMU-MP-1 抑制Hippo/MST1信号具有改善PND 模型小鼠学习、记忆能力的作用。

目前PND 发生最被接受的机制是神经炎症，尤其是在海马区的神经炎性反应。手术创伤引起的外周炎性细胞因子可以通过特定受体进入中枢神经系统（CNS），在血脑屏障上主动转运，随后激活小胶质细胞，释放更多的炎性介质，在中枢神经系统中产生炎性反应，从而干扰神经元和突触的连接和传递功能，最终导致PND 的发生[13]。PND 小鼠模型中，骨科手术诱导的海马依赖性记忆障碍被发现与白细胞介素（IL）-1β激活介导的海马神经炎症有关[14]。此外，在PND 老年大鼠模型中，TNF-α 是一种强大的促炎细胞因子，在炎症发生发展过程中起着关键作用。它可以诱导神经元死亡，并通过介导外周突触不稳定性引起感觉和认知缺陷，而抑制TNF-α 与认知功能障碍的改善相关[15]。研究[16-17]表明，老化的大脑更容易受到外周手术应激的影响，并因此诱发过度的炎症级联反应，而老龄动物在外周免疫挑战后也更容易出现认知衰退[18]。故本实验通过老龄小鼠胫骨骨折髓内钉固定术建立PND 小鼠模型，并选用海马组织神经炎性因子TNF-α、IL-1β 作为研究指标。

Morris 水迷宫实验是测试和评价动物空间学习记忆认知能力最常用的实验方法，在水迷宫空间探索实验中，选取目标象限停留时间百分比、逃避潜伏期、穿台次数、游泳速度4 个指标进行对比分析。结果显示，与Sham 组相比，PND 组小鼠术后逃避潜伏期延长、目标象限停留的时间百分比缩短、穿台次数减少，另外，PND 组与Sham组小鼠在游泳速度方面差异无统计学意义，小鼠游泳的动力主要靠前爪，胫骨骨折术后不影响老龄小鼠的游泳速度。以上结果表明，PND 组小鼠的空间学习、记忆能力相比Sham 组小鼠减弱，表明PND 小鼠模型制作成功。

炎症介导的神经功能障碍与MST1 的激活密切相关[19]。在蛛网膜下腔出血模型中，给予MST1抑制剂XMU-MP-1 可减轻神经功能缺损，并通过NF-κB 信号通路抑制神经炎症发生，从而发挥脑保护作用[20]。由此可知，Hippo/MST1 信号下调在中枢神经系统中发挥着重要的脑保护与抗炎作用。此外，Hippo/MST1 信号对小鼠的学习记忆功能也发挥重要的作用。海马中MST1 的上调会损害小鼠的空间记忆[21]。MST1 基因沉默减少了海马炎性细胞因子的异常表达，并使学习记忆能力得到改善[22]。但Hippo/MST1 信号是否对外周手术应激诱导的学习记忆功能障碍以及神经炎性反应具有保护作用，目前尚未见报道。本课题组推测可通过调节Hippo/MST1 信号改善PND小鼠的学习记忆能力及炎性反应。结合本研究结果显示，与Sham 组比较，PND 组小鼠手术后海马区P-MST1 表达上调，海马组织中TNF-α、IL-1β 表达水平升高，但使用抑制剂XMU-MP-1 抑制P-MST1 表达后，小鼠海马组织中P-MST1 蛋白的表达下降，TNF-α、IL-1β 表达水平下调，并且PND 老龄小鼠的学习和记忆功能得到改善。因此推测磷酸化MST1 蛋白的下调可能与减轻神经炎症，进而改善学习和记忆功能有关，并最终减少PND 的发生。

本研究存在一些局限性。首先，未使用Hippo/MST1 信号激动剂进一步验证过度激活Hippo/MST1 信号是否会在PND 中发挥加重炎症的作用；其次，研究中仅使用XMU-MP-1 下调磷酸化MST1 蛋白表达，在未来的研究中将使用基因敲除小鼠进行进一步验证。

综上所述，Hippo/MST1 在老年小鼠PND 模型中异常激活，P-MST1 表达水平增高，抑制PMST1 表达可能通过下调海马区炎症因子表达使PND 老年小鼠认知功能改善，提示Hippo/MST1激活在PND 的发病机制中起着重要的作用，抑制MST1 激活可能是PND 治疗的潜在新靶点。