NLRP3 炎症小体在小鼠手术模型诱导全身性炎性反应中的作用

蒋 鑫， 任 艺， 柳媛媛， 汪 蕊， 马 刚

（1. 宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院麻醉科，银川 750004； 3. 宁夏医科大学总医院消化内科，银川 750004； 4.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004）

手术是现代医学治疗疾病的重要方式，但手术创伤引发的并发症近年越来越受到关注，大量临床研究表明，术后并发症多以炎性反应为基础[1-2]，如心脏手术后的急性肾损伤[3]、认知功能障碍以及腹部大手术后的肺损伤[4-5]。因此，如何有效防治术后炎性反应成为亟须解决的临床问题[6-7]。NLRP3（NOD-like receptor protein 3）是NOD 样受体蛋白家族成员，其在NLRP3 炎症小体中承担着接收炎性信号的作用[8]。NLRP3 主要由3 个结构域组成，包括中央核苷酸结合和寡聚化（NACHT）结构域，富含亮氨酸的重复序列（LRR）以及pyrin 结构域（PYD）[9]。当肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素（interleukin，IL）-1β 等炎性信号刺激LRR 后，NACHT 结构域会促使PYD 结构域与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）结合，将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 前体（pro-caspase-1）剪切成活化的caspase-1[10-11]，活化的caspase-1 将促进IL-1β 和IL-18 剪切成熟[12]，诱发炎性级联反应[13-15]，造成多个器官损害[16-18]。虽然NLRP3 炎症小体活化是炎性发展的关键因素之一，但NLRP3 炎症小体是否参与外周手术诱导全身无菌性炎性反应尚不明确。为此，本研究通过动物实验来探讨NLRP3 炎症小体在外周手术介导的全身性炎性反应中的作用，以期为炎性相关术后并发症的防治提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究通过了宁夏医科大学伦理委员会批准（2018-020）。14 只8 周龄雄性C57BL/6J 小鼠（25±3）g 采购并饲养于宁夏医科大学实验动物中心。NLRP3 抗体（ab263899）购于Abcam 公司。BCA 蛋白定量试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司。IL-1β（EK0394）和IL-18（EK0433）ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。总RNA 提取试剂盒（AP-MX-MS-RNA-10G）购自康宁公司，第一链cDNA 合成试剂盒、定量PCR 试剂盒（AQ601）均购自北京全式金生物技术股份有限公司，所有引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 小鼠饲养环境整洁安静，饲养条件维持12 h/12 h 白昼循环光照，室温（24±2）℃，相对湿度60%～80%，小鼠自由摄食和饮水。适应性饲养1 周后，随机分为对照组和手术组（7 只/组）：对照组不做任何处理；手术组依据文献方法[19]，采用双侧颈动脉剥脱手术，即禁食12 h 后称重，然后经腹腔注射4%的水合氯醛（按剂量：0.1 mL/10 g）麻醉，颈前部剃毛，采用碘伏消毒。麻醉诱导10 min 后，切2.2 cm 的中线颈部切口，分离出1 cm 长的双侧颈动脉，在避免损伤迷走神经的情况下，机械刺激血管壁100 次。生理盐水冲洗伤口后，缝合手术部位。全程在无菌条件下进行，持续30 min。麻醉期间，恒温加热毯维持小鼠体温在37 °C。处理24 h 后，麻醉小鼠并采集小鼠血液样本，颈椎脱臼处死小鼠后收集肝组织、脾组织及脑组织用于后续实验。

1.2.2 定量PCR 检测不同组织IL-1β 和IL-18 mRNA 表达 采用动物组织总RNA 提取试剂盒在术后24 h 提取小鼠肝脏、脾脏和脑组织中总RNA，参照第一链cDNA 合成试剂盒说明书进行逆转录反应。取逆转录反应产物，参照mRNA 实时荧光定量试剂盒说明书实施qPCR 扩增。反应程序：94 ℃30 s，94 ℃5 s，60 ℃30 s，共44 个循环，GAPDH 为mRNA 内参，经2-△△Ct计算mRNA 相对表达量（表1）。

表1 qPCR 采用的引物序列

1.2.3 Western blot 检测不同组织NLRP3 蛋白表达情况 术后24 h 收集各组小鼠肝组织、脾组织和脑组织，用超声研磨仪在4 ℃条件下研磨1 min，并于冰上进行30 min 裂解。随后，4 ℃、12 000×g离心10 min 并收集上清液。BCA 法测定总蛋白浓度，进行SDS-PAGE（120 V，60 min）。经90 min 转膜后，用50 g·L-1脱脂牛奶封闭1 h；兔抗NLRP3 单克隆抗体（1∶10 000）、兔抗β-actin多克隆抗体（1∶10 000）、兔抗GAPDH 多克隆抗体（1∶10 000）4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶20 000），室温孵育1 h。TBST 清洗后加入ECL 反应底物并在暗室曝光和底片扫描，通过Image J 计算蛋白质条带灰度值。

1.2.4 炎性因子IL-1β 和IL-18 表达的检测 采用ELISA 检测试剂盒检测IL-1β 和IL-18 浓度，收集各组全血和脑组织进行样品制备；血浆：全血于4 ℃1 000×g离心10 min，取血浆检测；脑组织：组织按比例（100 mg 组织加入1 mL 裂解液）与组织裂解液混合冰上裂解30 min，4 ℃11 000×g离心5 min 取上清液检测。ELISA 试剂盒室温（25～28 ℃）平衡30 min；配制1×洗涤液；取出所需板条放置在框架内。设置标准孔和样本孔并加入标准品或待测样本；加入生物素标记抗体；37 ℃恒温孵育30 min；加入洗涤液反复洗板5 次；加入酶标抗体；恒温孵育结束后反复洗板5次；加入底物A 和B，混匀后封住反应孔孵育15 min；加入终止液终止反应，混匀后立即上机检测各孔的光密度（OD）值。以标准品浓度为横坐标，对应OD 值为纵坐标在Excel 工作表中绘制标准曲线，R2＞0.99，按照曲线方程式得出各样本浓度。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.01 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本比较采用t检验，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术诱发小鼠血浆炎性因子表达水平变化

ELISA 法检测小鼠血浆炎性因子水平结果显示，术后24 h 手术组小鼠血浆中IL-1β 水平［（14.02±0.83）pg·mL-1］高于对照组［（11.47±0.23）pg·mL-1］（P＜0.01）。

2.2 手术诱发小鼠肝脏IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表达水平变化

qPCR 和Western blot 检测结果表明，与对照组相比，手术组小鼠IL-1β mRNA、IL-18 mRNA和NLRP3 蛋白水平均增高（P均＜0.05），见图1。

图1 肝脏IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表达水平比较

2.3 手术诱发小鼠脾脏IL-1β、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表达水平变化

qPCR 和Western blot 结果显示，与对照组相比，手术组小鼠脾脏组织IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白水平均增高（P均＜0.05），见图2。

图2 脾脏IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表达水平比较

2.4 手术对脑组织IL-1β mRNA、IL-18 mRNA及其蛋白和NLRP3 蛋白表达的影响

qPCR 结果表明，手术组小鼠IL-1β 和IL-18 的mRNA 水平均高于对照组（P均＜0.05）。ELISA 法检测结果显示，手术组小鼠脑组织IL-1β 和IL-18 蛋白水平均高于对照组（P均＜0.01）。Western blot 结果显示，手术组NLRP3 蛋白水平较对照组增多（P＜0.05），见图3。

图3 脑组织IL-1β、IL-18 mRNA 及其蛋白和NLRP3 蛋白表达水平的影响

3 讨论

手术可以导致全身性炎性反应，若不能有效控制，则会引发一系列术后并发症[20-22]。本实验参考相关文献[19]，制作经典的颈动脉剥脱手术模型来观察手术对血浆、脑、肝脏等器官炎性反应的影响。

本研究发现，小鼠术后24 h 外周血中IL-1β较对照组增高，表明手术可以诱发血中炎性因子表达增高。研究[23]表明，手术可引起外周循环IL-1β 等炎性因子表达增高。但关于NLRP3 炎症小体在其中作用的研究较少。NLRP3 炎症小体激活后可介导多种炎性疾病的发生、发展，推测手术后局部无菌性炎性反应可通过炎性因子和免疫细胞激活NLRP3 炎症小体，产生更多的IL-1β，加重肝脏、脾脏、脑等重要器官损伤。

肝脏存在大量的巨噬细胞等免疫细胞，这些细胞中含有丰富的NLRP3 蛋白，NLRP3 在肝脏的急性损伤过程中起着关键作用[24]。本研究结果显示，肝组织中NLRP3、IL-1β 和IL-18 表达在术后24 h 增高，表明手术通过激活NLRP3 炎症小体导致肝脏产生炎性反应。近期一项关于脾脏焦亡的研究发现，NLRP3、IL-1β 和IL-18 发挥着至关重要的作用[25]。本研究结果显示脾脏NLRP3、IL-1β 和IL-18 表达增高，表明手术可通过NLRP3 炎症小体影响到脾脏的炎性反应。

脑是炎症发生后最易受炎性因子侵犯的器官之一。炎性因子可通过直接和间接途径通过血脑屏障，引发大脑炎性级联反应[20]。大量的IL-1β积累可以引起神经细胞不同程度的损伤，从而影响到脑功能，这种损伤可以通过减少IL-1β 的产生来缓解[26-27]。也有研究[28]表明，抑制IL-18 可以加速修复中枢神经系统的髓鞘，从而削弱神经反应后的损伤作用。本研究还发现，手术后脑组织IL-1β 和IL-18 的mRNA 表达增高，同时，IL-1β和IL-18 蛋白表达增高。IL-1β 和IL-18 主要通过NLRP3 炎症小体相关通路剪切、激活。本研究也观察到手术后脑组织NLRP3 蛋白表达明显增加。这些结果表明，NLRP3 炎症小体通路参与了手术引发的中枢炎性反应。Fan 等[29]通过使用MCC950 抑制NLRP3 炎性小体改善了异氟醚麻醉诱发的中枢炎性反应，因此，推测阻断NLRP3可能会减轻手术导致的中枢炎性反应。

本研究结果显示，手术后小鼠肝脏、脾脏、脑组织均有不同程度的炎性反应及NLRP3 炎症小体相关蛋白表达增高，但并未进行更加深入的机制研究，也未观察这些器官的功能变化，将在将来的实验中进一步探索。

综上所述，本研究通过动物实验验证了手术可以激活NLRP3 炎性小体，促使炎性因子大量产生，诱导全身性炎性反应的发生。NLRP3 炎症小体可能是防治围术期炎性反应的一个重要靶点。