间充质干细胞诱导的神经干细胞对脑出血大鼠的神经保护作用

刘佳鑫， 曹传尚， 金毅然， 马晓娜， 李家辉， 郭松林， 牛建国， 梁雪云

（1.宁夏医科大学总医院，宁夏干细胞与再生医学重点实验室，银川 750004；2. 宁夏医科大学，宁夏颅脑疾病重点实验室，银川 750004）

脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中出血性脑卒中占全部脑卒中的15%左右[1]。尽管脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）发病率低于脑缺血，但其更高的病死率和致残率值得高度重视[2]。ICH 通常表现为脑内动脉突然破裂，血液释放压迫周围脑组织，引起颅内压迅速升高，继而导致脑水肿，导致炎症、氧化应激的发生和血脑屏障破坏[3-4]。当前对于ICH 的治疗主要体现在手术清除血肿、药物止血以及调节血压[5]，但疗效以及预后仍不理想，给患者以及社会带来沉重的负担[6]。因此，探寻理想的ICH 治疗手段仍是当前研究者面临的一项挑战。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其具有自我更新、免疫原性低、多向分化潜能及免疫调节等生物学特性[7]，已被应用于治疗多种疾病的动物模型中，例如ICH[8]、脑缺血[9]、脊髓损伤[10]、糖尿病[11]、关节炎等[12]，并展现出良好的治疗效果。MSCs 对ICH 具有一定的治疗作用[13]，但是对于ICH 这类神经系统损伤的疾病，移植神经干细胞（neural stem cells，NSCs）对神经系统的损伤修复可能更精准、更高效[14-15]。内源性NSCs 来源有限，不能满足临床移植所需，且不易对其标准化制备[16]。研究[17-18]发现，MSCs 具备在一定条件下能被诱导分化为NSCs 的潜能，这将为解决NSCs 移植治疗ICH 等疾病面临的细胞数量少、细胞标准化制备等难题提供新思路。

本课题组前期已经将胎盘间充质干细胞（placental mesenchymal stem cells，pMSCs）在诱导培养基的作用下诱导生成神经干细胞（induced neural stem cells，iNSCs）[19]，且iNSCs 条件培养基具有良好的抗氧化特性，能够促进受损海马神经干细胞的修复[20]。因此，本研究将进一步探讨iNSCs 对ICH 大鼠的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

实验中所用P3 代次的pMSCs 由宁夏医科大学总医院宁夏干细胞与再生医学重点实验室提供，细胞的采集及获取获得宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（伦理编号：2020-289）。实验所用的SPF 级SD 雄性大鼠（250～280 g）购自宁夏医科大学实验动物中心，并按宁夏医科大学实验动物伦理规定进行操作。Neurobasal-A Medium、B-27 Supplement（50×）、N-2 Supplement（100×）、胰蛋白酶、GlutaMAXTMSupplement、磷酸缓冲盐溶液（PBS）购自美国Gibco 公司；UltraCULTURETMSerum-free Medium 购自瑞士LONZA 公司；ultroser G 血清替代物（ultroser G serum substitute，UG）购自美国PALL 公司；表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）购自美国PeproTech 公司；Heparin 购自加拿大STEMCELL公司；层粘连蛋白包被液购自瑞典BioLamina 公司；Ⅶ型胶原酶购自美国Sigma-Aldrich 公司；兔抗Sox-2、β-actin，山羊抗兔CoraLiteR488 购自美国Proteintech 公司；兔抗GAP-43、超氧化物歧化酶（SOD），鼠抗NeuN，山羊抗兔Alexa FluorR555、H&L（HRP），山羊抗鼠Alexa FluorR488 均购自英国Abcam 公司；兔抗Nestin 购自美国Invitrogen 公司；兔抗Cleaved-Caspase-3 购自美国Affinity 公司；A 型胶原酶购自瑞士Roche 公司；异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；尼氏染色试剂盒、HE 染色试剂盒、4%多聚甲醛、羊血清、含DAPI 封片剂购自北京索莱宝科技有限公司；ECL 检测试剂盒购自凯基生物公司；CO2恒温培养箱、PRIMO 台式高速离心机购自美国Thermo Fisher 公司；倒置显微镜购自日本Olympus 公司；其他细胞培养皿、细胞培养板、细胞筛等耗材购自美国Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 pMSCs 分离及培养 pMSCs 采集方法沿用课题组前期研究[21]，简要描述如下：获取人源性胎盘母体侧组织，采用无菌操作方法将其剪碎，PBS 洗涤后用0.1%的A 型胶原酶于37 ℃水浴处理2 h，每隔20 min 颠倒混匀，并将消化后的细胞悬液通过100 μm 的细胞筛，离心并弃掉上清液，加入适量培养液，将细胞混合液转至培养皿中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞密度至80%左右进行传代。

复苏P3 代次的pMSCs 并将其培养于添加了UG 的通用型无血清培养基（ultraculture serumfree medium）中，次日换液，待细胞密度达到80%左右，传代扩增至P5 代用于诱导神经干细胞。

1.2.2 iNSCs 诱导方法 配制iNSCs 诱导培养基，其比例分别为Neurobasal-A Medium（97%）、B-27（2%）、N-2（1%）、bFGF（10 mg·L-1）、EGF（20 mg·L-1）、Heparin（2 mg·L-1）。将细胞数为2×106的P5 代pMSCs 重悬于10 mL 的iNSCs 诱导培养基中并接种在100 mm 的细胞培养皿悬浮诱导，每3 d 向培养皿中补充3 mL 的诱导培养基，只补液不弃液。

1.2.3 iNSCs 及pMSCs 的免疫荧光染色鉴定 复苏P5 代次的pMSCs，以及在诱导后第7 天，收集直径在100 μm 左右的iNSCs，将其轻柔吹散成单个细胞，将上述细胞接种在预先用层粘连蛋白包被的12 孔板中，过夜培养，待次日细胞贴壁后，弃掉培养液，PBS 清洗2 遍，用4%的多聚甲醛室温固定细胞20 min，加入0.5% Triton X-100室温破膜20 min，再用5%的羊血清室温封闭1 h后，分别与以下一抗，即Nestin（1∶200）、GAP-43（1∶500）、Sox-2（1∶500）于4 ℃孵育过夜。次日用PBS 清洗3 次，每次10 min，然后分别加入荧光二抗Alexa FluorR555（1∶500）或CoraLiteR488（1∶500）室温避光孵育2 h。加入DAPI 染液对细胞核染色，并在荧光显微镜下观察采集图像。每组蛋白鉴定设置3 个复孔，每个样本孔随机拍摄5个视野，计算阳性细胞率，最后再计算出各组蛋白阳性细胞率的均值。

1.2.4 大鼠ICH 模型 将大鼠随机分为假手术组（Sham 组）、脑出血组（ICH 组）和诱导的神经干细胞移植组（iNSCs 组），每组10 只。用异氟烷麻醉大鼠，将其固定在手术台面，备皮，碘伏消毒，沿两眼中点做矢状切口暴露前囟，以前囟为坐标原点，向后0.2 mm，向左旁开3.0 mm，深度6.0 mm 为左侧纹状体内囊定位点，用微量注射器以0.4 μL·min-1的速率缓慢注射2 μL 的Ⅶ型胶原酶（0.2 U）。注射结束需停针10 min，垂直缓慢拔出针头，并用骨蜡封闭针孔以及缝合伤口。ICH 模型以注射Ⅶ型胶原酶24 h 完成，Sham组在不注射胶原酶的情况下进行相同的操作。

1.2.5 iNSCs 原位移植 将iNSCs 用胰酶预处理5 min 后，用培养基终止消化并轻柔吹打，使其成为单个细胞。大鼠麻醉、固定及纹状体定位同ICH 造模方法。当Ⅶ型胶原酶注射24 h 后，将1×106/30 μL 的iNSCs 用量程为100 μL 微量注射器原位缓慢注射到ICH 大鼠左侧纹状体内囊，退出针头，并用骨蜡封闭针孔以及缝合伤口。Sham组和ICH 组注射等体积的PBS，其他操作相同。

1.2.6 神经功能评估 1）前肢放置实验：用于评估动物的感觉运动功能障碍，实验前，让动物放松，轻柔抓住大鼠使其四肢自由悬空，让大鼠的右侧胡须触碰桌角，诱导其将前肢放置于桌面，大鼠发生ICH 后，会对侧前肢放置呈现一定障碍，每只大鼠测试10 次，记录大鼠右侧前肢放置成功的百分率反映动物的损伤情况。分值越高，代表动物损伤情况相对越小。2）转角实验：用以评估动物的肢体协调功能的损伤情况，将大鼠置于由两块挡板形成的30°夹角装置中，大鼠会转身，每只大鼠测试10 次，记录大鼠右转的百分率，每次测试间隔＞30 s。分值越高，代表动物损伤情况相对越小。3）改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）：用以反映动物神经功能缺损情况，主要包括对动物的运动、感觉、反射、平衡、肌力等功能的评价，其分值量化为0～18 分，分数越高，表明神经功能缺损越严重。

1.2.7 标本制备 将大鼠麻醉后，暴露心脏，将灌注针头沿左心室插入主动脉，剪开右心耳，并灌注生理盐水，待右心耳流出的液体变澄清时，换4%的多聚甲醛继续灌注，待动物肢体变硬后，停止灌注并取出整个脑组织，置于4%的多聚甲醛4 ℃过夜，30%的蔗糖溶液脱水完成后，去除脑干和小脑，以进针点的冠状面为基准，向其前后各延伸1 mm，获取2 mm 厚度的脑组织切片，并制备厚度为10 μm 的冰冻切片用于后续的组织免疫荧光、HE 及尼氏（Nissl）染色。

1.2.8 血肿体积量化 取材各组大鼠脑组织切成连续的组织切块用以观察血肿大小，并用Image J 量化各组大鼠脑组织的血肿大小，计算公式：血肿体积率（%）=血肿体积/全脑体积×100%。

1.2.9 HE 和Nissl 染色 HE 染色用以观察脑组织周围正常和病变细胞的形态、数量及分布情况。Nissl 染色用以观察神经元胞质和树突内的尼氏小体的大小和数量。根据HE、Nissl 染色试剂盒的说明，将各组冰冻切片按照提示进行染色，在正置显微镜下观察并采集图像。

1.2.10 组织免疫荧光染色 将各组厚度为10 μm的冰冻切片用PBS 洗涤3 次，每次10 min。滴加0.5% Triton X-100 室温破膜20 min，5%的羊血清室温封闭1 h，分别与以下一抗，即NeuN（1∶200）、Cleaved-Caspase-3（1∶300）于4 ℃孵育过夜。次日将切片用PBS 洗涤3 次，每次10 min，然后分别加入荧光二抗Alexa FluorR555（1∶500）或Alexa FluorR488（1∶500）室温避光孵育2 h，并在切片上滴加DAPI 染液，封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.11 Western blot 检测 麻醉各组大鼠，迅速取出全脑，以注射点的冠状面为基准向其前后分别扩展1 mm，获取厚度为2 mm 的脑组织，并分离出损伤侧纹状体组织，迅速放入液氮速冻，再转入-80 ℃冰箱保存。向分离的脑组织中加入蛋白裂解液，并于组织研磨仪中研磨15 min，然后在4 ℃下，12 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，并用BCA 试剂盒测取样品中的蛋白质浓度。将蛋白质总含量为50 μg 的样品加载到10%的SDS-PAGE 凝胶中分离各类蛋白质，湿转至PVDF 膜上，并用5%的脱脂奶粉封闭2 h。随后分别在4 ℃下孵育SOD，β-actin 一抗过夜，次日用Tris 缓冲盐溶液（TBST）清洗3 次后加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，对膜上的蛋白条带用ECL 检测试剂盒通过凝胶成像系统显影。用Image-J 软件分析各组蛋白条带相对表达量。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0 进行绘图和统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组样本均数的比较采用t检验，多组间的均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pMSCs 诱导成iNSCs 形态学变化

pMSCs 是一种呈梭形、旋涡状生长的贴壁细胞，将pMSCs 用诱导培养基悬浮诱导，可在24 h后发现细胞开始聚集成团生长，并有少量小细胞团出现。在第7 天可见大量直径在100 μm 左右状态良好的iNSCs，iNSCs 折光性强，细胞之间聚合紧密呈桑葚样或球体形态，见图1。

图1 iNSCs 诱导成球过程光镜图

2.2 pMSCs 及iNSCs 表达神经干细胞相关标志蛋白的鉴定

对pMSCs 及iNSCs 进行神经干细胞标志蛋白鉴定，结果显示，85%以上的iNSCs 均表达Nestin、Sox-2 及GAP-43，而pMSCs 低表达上述蛋白（P均＜0.05），见图2。

图2 pMSCs 及iNSCs 免疫荧光染色鉴定

2.3 iNSCs 移植有效降低ICH 大鼠脑血肿体积

iNSCs 移植后在第7 天，取材各组大鼠脑组织并测量血肿大小。Sham 组大鼠脑血肿体积率为（0.5±0.1）%，ICH 组为（9.2±0.6）%，iNSCs 组为（5.6±0.9）%。与ICH 组比较，iNSCs 组大鼠的脑血肿体积率降低（P＜0.05），见图3。

图3 iNSCs 移植对ICH 大鼠血肿体积的影响

2.4 iNSCs 移植有效改善ICH 大鼠神经功能缺失

iNSCs 移植后第7 天，前肢放置试验、转角试验和mNSS 评分的结果显示，与ICH 组比较，iNSCs 组大鼠的前肢放置成功率和右转成功率升高，mNSS 评分下降（P均＜0.05），见图4。

图4 iNSCs 移植对ICH 大鼠神经功能缺失影响

2.5 iNSCs 移植有效改善ICH 大鼠神经元损伤程度

对各组脑切片进行HE 以及尼氏染色。HE染色结果显示，Sham 组大鼠的细胞形态规则，分布均一，胞体完整，染色均匀。ICH 组大鼠可见大量的炎细胞浸润，细胞肿胀，胞膜边界不清，细胞排列紊乱。而与ICH 组比较，iNSCs 组大鼠的细胞肿胀减轻，炎细胞浸润减少，细胞排列相对均匀。尼氏染色结果显示，Sham 组大鼠的尼氏小体阳性的神经元数量较多，神经元内的尼氏小体含量高，细胞形态规则，染色均匀。ICH 组大鼠的尼氏小体阳性的神经元比例减少，部分细胞形态不规则，胞膜破碎，染色较浅。而与ICH 组比较，iNSCs 组大鼠的尼氏小体阳性神经元百分率增加（P＜0.05），凋亡退化的神经元数量减少，细胞形态相对规则，染色均匀，见图5。

图5 iNSCs 移植对ICH 大鼠神经元损伤的影响

2.6 iNSCs 移植有效抑制ICH 大鼠血肿周围神经元的凋亡

各组脑切片NeuN/Cleaved-Caspase-3 免疫荧光双标染色分析结果显示，与Sham 组比较，ICH 组大鼠血肿周围NeuN/Cleaved-Caspase-3阳性的凋亡神经元数量增加（P＜0.05）；与ICH 组比较，iNSCs 组大鼠血肿周围凋亡神经元数量减少（P＜0.05），见图6。

图6 iNSCs 移植对ICH 大鼠血肿周围神经元凋亡的影响

2.7 iNSCs 移植有效提高ICH 大鼠血肿周围SOD 蛋白的表达

Western blot 结果显示，与Sham 组比较，ICH组大鼠SOD 蛋白的表达水平降低（P＜0.05）；与ICH 组比较，iNSCs 组大鼠SOD 蛋白的表达水平升高（P＜0.05），见图7。

图7 iNSCs 移植对ICH 大鼠血肿周围SOD 蛋白表达的影响

3 讨论

ICH 是一种极具破坏性的脑血管病，一旦发生，会促使脑组织中的大量神经细胞死亡，引发神经炎症和神经功能障碍，继而导致患者偏瘫或死亡[22]。然而，当前常规的手术疗效有限，对于ICH 的长远治疗急需探寻新型理想的治疗手段。有研究[23]发现，神经干细胞具有免疫调节以及多向分化的潜能，能够向大脑损伤区分化为神经元和星形胶质细胞，帮助损伤区的神经网络重建，对于ICH 疾病的治疗表现出巨大的潜力。内源性NSCs 主要存在于大脑脑室下区和海马齿状回颗粒下区，数量较少，其临床应用受限[24]。有研究[25]利用干细胞多向分化的特性，将诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）诱导为神经嵴干细胞用于增强神经肌肉再生。并且MSCs 来源广泛，也具备向NSCs 分化的特性[18]，提示可将MSCs 诱导分化为NSCs 用以弥补内源性NSCs 数量稀少等不足。以往的研究[20]发现，MSCs 诱导分化的iNSCs 在治疗神经损伤中具有较好的潜力。本研究重点观察了iNSCs 移植治疗ICH 大鼠的效果及其对损伤区神经元的影响，目前类似的研究较少。

Nestin、Sox-2 是神经干细胞的标志蛋白[26]，GAP-43 是神经生长相关蛋白，在神经发育和轴突再生中具有重要意义[27]。本研究鉴定了iNSCs表达神经干细胞相关蛋白的情况，发现其高表达神经干细胞的标志蛋白Nestin、Sox-2 以及促进神经发育的GAP-43 蛋白，说明成功将间充质干细胞诱导成了具有神经干细胞特性的细胞。

纹状体内囊为常见的ICH 部位，内囊出血后通常引起严重运动神经功能障碍[28]。为了评价iNSCs 对ICH 大鼠的治疗效果，本课题组构建了大鼠纹状体出血模型后，将iNSCs 原位移植于ICH 大鼠内囊区。结果发现，iNSCs 移植能够改善ICH 大鼠的运动功能。

ICH 会引发神经元凋亡[29]，Caspase-3 是细胞凋亡中的关键蛋白，Cleaved-Caspase-3 是其活性形式[30]。本研究将NeuN 与Cleaved-Caspase-3 共同标记用以观察各组神经元凋亡情况，结果发现，iNSCs 移植抑制了ICH 大鼠神经元的凋亡。同时，组织形态学结果表明，iNSCs 移植能够减轻ICH 造成的脑组织炎细胞浸润，促进损伤区受损神经元修复。以上结果均证明，iNSCs 移植可以通过保护损伤区神经元，进而促进ICH 大鼠神经功能恢复。

细胞过氧化损伤是ICH 的病理改变之一，SOD 是一种具有抗氧化应激特性的蛋白[31]。过表达铜锌超氧化物歧化酶（copper/zinc-superoxide dismutase，SOD1）的神经干细胞通过其旁分泌功能和抗氧化损伤能力发挥对ICH 大鼠的神经保护作用[32]。本研究发现，iNSCs 移植可提高ICH 大鼠大脑SOD 蛋白表达水平，说明iNSCs 可能通过良好的抗氧化功能发挥其神经元保护功能。

综上所述，iNSCs 可能通过发挥其抗氧化作用，抑制受损神经元凋亡，进而促进神经功能恢复。后续将进一步探讨iNSCs 发挥神经保护作用的具体机制。本研究结果将为今后临床应用iNSCs 移植治疗ICH 提供理论基础。