马铃薯响应低温胁迫的蛋白质组学分析

李文翔 王舰 王芳

摘 要 为探究马铃薯在蛋白质组学水平上对低温胁迫的响应机制，对耐低温品种‘DR-2与低温敏感品种‘费乌瑞它组培苗叶片蛋白质组学进行分析。结果表明，鉴定到肽段282 790个，唯一性肽段19 099个，蛋白质4 471个。通过Label-Free技术对叶片差异表达蛋白分析表明，低温胁迫下‘DR-2中有38个显著差异蛋白，‘费乌瑞它中有72个显著差异蛋白。筛选出代谢通路差异蛋白13个，包括代谢相关蛋白5个，光合作用相关蛋白3个，防御相关蛋白2个，运输相关蛋白3个。Pathway富集分析结果表明低温胁迫处理下，分布在光合作用、能量代谢通路中的3-磷酸甘油醛脫氢酶、钙网蛋白、热激蛋白、肌醇-3-磷酸合酶在叶片中差异表达，该结果对研究马铃薯低温响应机制具有一定参考价值。

关键词 马铃薯；低温胁迫；蛋白质组学；响应机制

低温是制约植物生长和发育最常见的非生物胁迫之一，对植物生长和生产均有不利影响。植物通过细胞到生理应答反应迅速启动相关基因进行转录后调控，合成相关蛋白，形成多个调控网络以响应低温胁迫[1]。作为基因表达的产物，蛋白质参与植物体内大部分生理功能的调节[2]。利用非标记定量蛋白质组学对低温胁迫中差异表达蛋白进行研究，可了解低温胁迫下蛋白质的变化，揭示其作用模式，鉴定潜在目标蛋白，从而在蛋白质水平上掌握胁迫因子伤害机制与植物适应机制。

利用蛋白质组学方法以不同组织作为蛋白质表达的研究已在水稻[3]、玉米[4]、小麦[5]、拟南芥[6]等植物中报道。欧文军[7]在木薯叶片中鉴定出34个差异蛋白通过维持光合作用、能量代谢和分子伴侣等表达以响应低温胁迫。Rocco等[8]短期低温处理拟南芥后发现蛋白质数量增加，主要参与能量产生和碳代谢等途径。唐秀英等[9]对不同品种水稻低温处理，发现苗期根系差异蛋白主要在碳代谢、次级代谢产物合成等途径中起催化结合作用。

马铃薯作为一种重要的主粮作物，由于适应能力强、增产潜力大等特点，已成为仅次于小麦、水稻的第三大粮食作物[10]，在全球范围广泛种植。马铃薯喜冷凉，但温度低于10 ℃时对幼苗生长不利，苗期遭受低温伤害后诱导体内可溶性糖和蛋白质生成，保护植株免受低温伤害；同时光合作用受阻，导致植株停止生长，对产量造成影响[11]。国内对马铃薯蛋白质的研究主要集中在干旱胁迫[12]和生长发育[13]等方面，在低温胁迫方面的研究较少。本研究以Label-Free技术为主要研究手段，利用蛋白质组学方法挖掘马铃薯低温胁迫响应因子，筛选差异表达蛋白，为后续基因克隆和低温响应途径研究提供参考，也为抗性品种的遗传改良和培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以马铃薯（Solanum tuberosum L.）耐低温品种‘DR-2和低温敏感品种‘费乌瑞它组培苗为试验材料，由青海省农林科学院生物技术研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理方法 组培苗在MS培养基上培养15 d后，选取长势一致的组培苗进行试验。对照组转入人工气候培养箱，培养箱温度白天20 ℃、晚上18 ℃，光照度为10 000 lx，光照时间为12 h；处理组进行低温胁迫，温度为4 ℃，其余条件与对照组相同，设置3次重复。分别处理5 d后，每个重复取18株，将完整功能叶混样后液氮冷冻放入10 mL离心管，备用。

1.2.2 样品制备 用研钵液氮冷冻研磨样品，使用甲醇-氯仿沉淀法沉淀蛋白质，使用NanoDrop 进行蛋白定量，定量信息见表1。用FASP对全部蛋白质进行酶解：每例样品中分别加入适量DTT至终浓度为100 mmol/L，沸水浴5 min后室温冷却。转入10  ku超滤离心管去除分子量大于10 ku的大分子蛋白，12 000×g离心15 min，弃滤液。加入100 μL IAA，震荡混匀，室温避光放置30 min，12 000× g离心10 min，弃滤液。加入100 μL NH4HCO3，震荡混匀，14 000×g离心10 min，重复4次后加入40 μL Trypsin，充分振荡，37 ℃水浴16～18 h。换新收集管，12 000×g离心10 min，收集滤液，加入适量0.1% TFA溶液，酶解后的肽段使用C18 Cartridge对上清液进行脱盐处理，真空干燥。酶解后的肽段用0.1% FA复溶，取上清进行浓度测定，以备LC-MS/MS分析。

1.2.3 LC-MS/MS分析 每例样品取适量肽段使用纳升流速Easy nLC 1 200 色谱系统进行色谱分离。缓冲液：A液为 0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为 80%）。色谱柱以95%的A液平衡。样品进样到Trap Column（100 μm×20 mm，5 μm，C18，Dr. Maisch GmbH）后经过色谱分析柱（75 μm×150 mm，3 μm，C18，Dr. Maisch GmbH）进行梯度分离，流速为300 nL/min。液相梯度设置如下：0～3 min，B液线性梯度为2%～8%；3～98 min，B液线性梯度为8%～28%；98～108 min，B液线性梯度为28%～40%；108～110 min，B液线性梯度为40%～100%；110～120 min，B液维持在100%。肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪进行数据依赖采集质谱分析。分析时长为120 min，检测模式：正离子，母离子扫描范围：300～1 800 m/z，一级质谱分辨率：60 000 @m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：50 ms。肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱（MS2 scan），二级质谱分辨率：15 000 @ m/z 200，AGC target：1e5，二级Maximum IT：25 ms，MS2 Activation Type：HCD，Isolation window：1.6 m/z，Normalized collision energy：28。Label-free非标记定量分析委托上海拜谱生物科技有限公司进行。

1.2.4 蛋白质鉴定与数据库检索 采用检索软件MaxQuant 1.6.0.16进行质谱数据检索，参数设置见表2。

1.2.5 蛋白质定量与差异分析 MaxQuant是领先的蛋白质组学定性定量算法，已逐渐成为该领域内的标准解决方案之一[14]。在定量结果的显著性差异分析中，本试验筛选样本组内3次重复数据进行统计分析，视上下调差异倍数大于2且P小于0.05的蛋白质为显著差异表达蛋白质。采用两组样本间的蛋白质表达差异倍数和T检验得到的P两个因素共同绘制火山图，用于表现两组样本数据的显著性差异。

1.2.6 生物信息学分析 GO是一个标准化基因功能分类体系，从生物过程、分子功能和细胞组分三方面对目标蛋白质进行分类[15]，GO注释的显著性富集分析通过Fisher精确检验来评价。KEGG通路富集分析以所有定性蛋白质为背景，通过Fisher精确检验，来分析计算各个通路蛋白质富集度的显著性水平，从而确定受到显著影响的代谢和信号转导途径[16-17]。

2 结果与分析

2.1 蛋白质鉴定结果统计

对蛋白质鉴定结果统计，其中马铃薯品种‘DR-2对照组中鉴定肽段共计69 666个，唯一性肽段15 635个，蛋白组数目4 284个；低温处理组中鉴定肽段共计66 517个，唯一性肽段15 263个，蛋白组数目4 224个。马铃薯品种‘费乌瑞它对照组中鉴定肽段共计71 051个，唯一性肽段15 931个，蛋白组数目4 206个；低温处理组中鉴定肽段共计75 556个，唯一性肽段16 527个，蛋白组数目4 299个。本试验得到鉴定肽段共计282 790个，唯一性肽段共计19 099个，蛋白组数目共计4 471个。

2.2 蛋白质定量结果统计

利用DAA质谱数据，分析‘DR-2低温处理组与对照组、‘费乌瑞它低温处理组与对照组、‘DR-2低温处理组与‘费乌瑞它低温处理组和‘DR-2对照组与‘费乌瑞它对照组共4个对照组中的显著性差异表达蛋白质，分别筛选出显著差异蛋白总数为38、72、195和193，其中上调表达蛋白与下调表达蛋白结果见图1。

2.3 显著性差异蛋白质分析

红色点为上调表达蛋白质，绿色点为下调表达蛋白质，灰色点为非显著性差异蛋白质。蛋白质点的横纵坐标为离散度来表明蛋白质差异程度，离散度越大差异越大。各组间显著性差异蛋白见图2。

2.4 蛋白质聚类分析

本试验从样本和蛋白质定量信息两个维度进行分类，红色代表上调，蓝色代表下调。由图3可以看出低温胁迫和对照组的叶片差异蛋白上下调表达情况，每个处理的3组重复中相似性很高，说明本试验所筛选的目标差异蛋白质较合理。

2.5 GO富集分析

分析发现‘DR-2在低温处理与对照组的差异蛋白表现在33个生物过程、9个细胞组分、25个分子功能途径中。根据GO层级水平关系及富集程度筛选出主要参与低温胁迫应答的18个途径。由表3可知生物过程功能分类中，差异表达基因在单一生物合成及小分子代谢过程中富集度较高；L-抗坏血酸代谢过程只有一个上调表达基因。细胞组分功能分类中，细胞质中差异表达基因显著富集。分子功能分类中，催化活性GO term极显著富集，且占比最多，共22个基因富集；焦磷酸酶活性过程有5个基因富集，3-磷酸肌醇合酶活性占比较少，只有1个基因表达。GO term富集说明‘DR-2叶片响应低温胁迫的主要组分在细胞质中，通过激活焦磷酸酶、水解酶及3-磷酸肌醇合酶等活性催化更多蛋白质合成，参与有机酸的合成及小分子代谢、单糖代谢等过程来抵御低温胁迫。

分析发现‘费乌瑞它在低温处理与对照组的差异蛋白表现在61个生物过程、34个细胞组分、34个分子功能途径中。根据GO层级水平关系及富集程度筛选出主要参与低温胁迫应答的18个途径。由表4可知生物过程功能分类中，虽然有机物生物合成过程差异表达基因显著富集，但是P值相对较高；双糖、葡萄糖代谢以及对非生物刺激、光刺激和含氧化合物等反应表现出抑制下调状态。细胞组分中主要为细胞内部分。分子功能分类中，结构分子活性、热激蛋白结合、3-磷酸肌醇合酶活性等极显著差异，在氧化还原酶活性中显著富集。GO term富集说明‘费乌瑞它的叶片对氧化还原酶活性响应较强，可能是通过光系统Ⅱ产氧复合物促进热激蛋白的结合降低了双糖和葡萄糖反应速率，进而引起低温刺激应答基因的下调表达。

分析发现‘费乌瑞它低溫处理与‘DR-2低温处理的差异蛋白表现在175个生物过程、36个细胞组分、91个分子功能途径中。图4表示低温处理下，差异蛋白在3个类别中前10的显著富集GO term。生物过程功能分类中，小分子代谢、单一生物代谢过程等显著富集。细胞组分功能分类中，细胞质部分及叶绿体部分显著富集。分子功能分类中，氧化还原酶活性、催化活性等显著富集。GO term富集说明在低温胁迫下造成‘费乌瑞它与‘DR-2不同抗性的原因可能是由于不同马铃薯品种在叶片细胞质内与叶绿体类囊体、叶绿体膜等光合作用相关的细胞组分结合能力不同，通过催化氧化还原酶活性、水解酶活性、热激蛋白结合等，造成对糖代谢、有机物合成、非生物刺激等途径的不同反应导致对低温的不同抗性。

分析发现‘费乌瑞它对照组与‘DR-2对照组的差异蛋白表现在155个生物过程、30个细胞组分、65个分子功能途径中。图5显示‘费乌瑞它和‘DR-2对照组中，差异蛋白在3个类别中前10的显著富集GO term。

2.6 KEGG通路富集分析

通过KEGG通路富集分析（图6），4个差异蛋白在氨基酸生物合成和亚油酸代谢2个生物代谢途径中发生了显著性变化（P<0.05）。

如图7所示，13个差异蛋白显著富集在3个生物代谢途径中，其中光合作用、半膀氨酸和蛋氨酸代谢2个途径发生了极显著变化（P<0.01），氨基酸生物合成途径发生了显著性变化（P<0.05）。

DR-4D vs DR-CK比较组鉴定出相关差异蛋白4个，F-4D vs F-CK比较组鉴定出相关差异蛋白12个，相关差异蛋白鉴定信息见表5。

如图8所示，78个差异蛋白显著富集在9个生物代谢途径中，其中内质网中蛋白质加工、卟啉和叶绿素代谢、氨基酸生物合成、次生代谢产物的生物合成、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸的生物合成、谷胱甘肽代谢6个途径发生了极显著变化（P<0.01），精氨酸生物合成、光合生物中的碳固定、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢3个途径发生了显著性变化（P<0.05）。

如图9所示，71个差异蛋白显著富集在10个生物代谢途径中，其中内质网中蛋白质加工、光合作用、光合作用-触角蛋白、精氨酸生物合成、光合生物中的碳固定5个途径发生了极显著变化（P<0.01），丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、代谢途径、氨基酸生物合成、牛黄酸代谢5个途径发生了显著性变化（P<0.05）。

F-4D vs DR-4D比较组鉴定出相关差异蛋白33个，F-CK vs DR-CK比较组鉴定出相关差异蛋白34个，相关差异蛋白鉴定信息见表6。

3 讨论

3.1 能量代谢相关蛋白

3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）是植物体中将葡萄糖及糖原分解为丙酮酸过程的一种关键酶，催化3-磷酸甘油醛氧化脱氢和磷酸化生成的糖酵解途径的中间产物，并使得脱氢酶的辅酶NAD+生成NADH和H+，通过苹果酸等进入线粒体，经过氧化呼吸链的传递最终生成水和二氧化碳[18]。KEGG富集分析表明，对低温处理与对照组分析发现3-磷酸甘油醛脱氢酶在‘DR-2中上调表达，在‘费乌瑞它中下调表达；在低温处理下的‘费乌瑞它和‘DR-2中发现NAD脱氢酶和苹果酸酶下调表达，与GO富集分析结果葡萄糖代谢生物过程抑制下调表达结果一致。表明在低温胁迫下，由于马铃薯品种不同对3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达不同，导致对葡萄糖的分解能力不同，推测是造成‘DR-2耐低温性高于‘费乌瑞它的原因之一。

低温导致植物中渗透调节物质、酶活性和细胞结构等改变[19]，诱导植物体基因的上下调表达，进而产生冷胁迫相关特异蛋白[1]。肌醇-3-磷酸合酶（MIPS）作为一种磷蛋白，参与肌醇合成过程，在肌醇稳态中起着重要的作用。MIPS的磷酸化是生物肌醇合成的新型调节机制[20]。肌醇通过自身氧化代谢生成参与细胞壁合成的木聚糖及果胶[21]，促进细胞对养分的吸收利用，稳定植株胞内渗透压以提高对低温的耐受性。研究表明MIPS在拟南芥[22]、烟草[23]、水稻[24]中过表达增强了其对盐、干旱和低温胁迫的抗性； OsMIPS1的过表达增加了低温抗性，沉默表达则降低了水稻低温抗性[25]。植物细胞存在类三磷酸肌醇受体蛋白，参与磷脂酰肌醇系统信号转导[26]，通过对细胞膜液泡膜等结合调控，调节细胞分裂分化，推测本研究中低温处理下的‘费乌瑞它和‘DR-2肌醇磷酸合酶的上调表达稳固了植株胞内外环境，提高了低温抗性。

3.2 光合作用相关蛋白

热激蛋白（HSP）是植物细胞受逆境胁迫产生的一种维持生命活动的功能蛋白，热激70 ku蛋白上调表达可提高植株的抗逆性[27]。HSP70B的低表達可提高光系统Ⅱ的光敏感性，HSP70B的过表达具有保护作用[28]。GO富集与KEGG富集分析表明，热激70 ku蛋白的抑制下调可能是造成‘费乌瑞它中光系统Ⅱ产氧复合物及光合作用相关生物途径上调表达的原因。低温通过降低代谢酶的活性，最终影响光合效率。植物光合作用电子传递链在低温胁迫抑制后活性氧含量降低[29]。本研究发现在低温胁迫下‘费乌瑞它含氧化合物反应处于抑制下调状态，但是热激同源70 ku蛋白、psaC多肽蛋白、Psb28亚基蛋白上调表达，这可能是相关HSP与基因蛋白共同作用在一定程度上保护了低温环境下的‘费乌瑞它植株避免冻伤致死。

3.3 其他蛋白

钙网蛋白（CRT）是一种植物胞内分子伴侣，参与钙离子稳态过程的保守功能蛋白[30]。Komatsu等[31]研究表明CRT基因的过表达提高了水稻耐寒性。Sharma等[32]试验表明CRT基因可以响应水稻低温胁迫。本研究发现低温处理下的‘费乌瑞它中钙网蛋白下调表达，可能降低了植株胞内稳态，造成‘费乌瑞它低温抗性较‘DR-2弱，这与前人的研究一致。

ACO2是一种氧化酶基因，在木瓜中证实与果实成熟期的叶片衰老相关[33]。本研究中 ACO2基因上调表达，推测是造成叶片胞内活性氧积累，导致‘费乌瑞它低温敏感的原因之一。LOX是一种脂氧合酶，吴锦程等[34]表明低温胁迫下钙离子系统与膜脂氧合酶活性调控相关，廖晶晶[35]发现LOX10提高了薄皮甜瓜植株的耐旱性，本研究中LOX1.5在‘DR-2中上调表达，推测是稳固了膜系统结构，提高了低温耐受性。

4 结  论

不同马铃薯品种在生长发育过程中蛋白质的表达存在差异，试验结果表明：分布在光合作用、能量代谢等通路中相关蛋白的差异表达是造成马铃薯对低温不同抗性的主要原因。推测3-磷酸甘油醛脱氢酶、钙网蛋白、热激蛋白、肌醇-3-磷酸合酶在低温胁迫响应途径中十分重要，在后续试验中可对其进行验证。

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Abstract  In order to explore the response mechanism of potato to low temperature stress at the proteomic level，the leaf proteomic of the plantlets of the low-temperature-tolerant variety ‘DR-2 and the low-temperature sensitive variety ‘Favorite were analyzed in this study，the results showed that there were  282 790 peptides，19 099 unique peptides and 4 471 proteins，and  there were  38 differentially expressed proteins in ‘DR-2 and 72 differentially expressed proteins in ‘Favorite under low temperature stress by Label-Free technique. And 13 of them were screened outin metabolic pathways，including 5 metabolism-related proteins，3 photosynthesis-related proteins，2 defense-related proteins and 3 transport-related proteins. Pathway enrichment analysis results showed that glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，calreticulin，heat shock protein，and inositol-3-phosphate synthase distributed in photosynthesis and energy metabolism pathways were differentially expressed in leaves under low temperature stress. This study providesa reference for study  on the low temperature response mechanism of potato.

Key words Potato;Low temperature stress; Proteomics; Response mechanism