中生菌素及其复配对柑桔溃疡病菌室内活性试验研究

李双双,潘忠成,2*,张心心,潘子瑜,郑鹏飞,李金峰

(1.陕西麦可罗生物科技有限公司,陕西 渭南 714200;2.哈尔滨工程大学材料科学与化学工程学院教育部超轻材料重点实验室,哈尔滨 150001;3.哈尔滨商业大学食品科学与工程学院,哈尔滨 150001 )

柑桔溃疡病(CitrusBacterialCankerDisease,CBCD)是由地毯黄单胞杆菌(Xanthomonasaxonopodispv.Citri.Xac)柑桔致病变种引起的危害全球柑桔的重要作物病害,是国内外重点检疫对象[1-2]。该病害对柑桔作物造成的危害极大,感染的程度会因物种的不同和品种的差异以及栽培管理措施和气候条件等存在差异。柑桔溃疡病菌与与其他许多细菌性病害类似,其病原菌借助风雨、昆虫、修剪工具等从伤口、气孔等侵入植株[1]。病菌的寄主范围较广泛,主要对芸香科植物进行侵染,严重为害柑桔的叶、枝干及果实,引起叶片、枝干枝条及果实发生溃疡斑,严重影响作物的正常长势,产品品质及产量的下降,对柑桔作物生产影响重大[3]。病害侵染,叶背开始现类黄色极小油渍斑点,而后正背两面隆起圆形黄米色病斑,表皮出现裂痕,粗糙木质化,病部凹陷有黄色晕环出现。枝梢病斑较叶片病斑更加凸起,病部凹陷但无晕环,严重时叶枯枝枯,其中夏梢最严重。果实病斑较叶片病斑更大,火山状病斑裂痕更明显,同时病斑只会出现在果皮上,严重发生时会造成早期落果[4]。该病原菌适宜高温高湿环境,以秋梢为媒介越冬。湿温环境下借助风雨、枝叶接触和昆虫传播,潜伏期一般在3～10d,因品种而异。尤其每年台风、暴雨过后柑桔溃疡病大范围发生。

该病在我国大部分的柑桔主要产区都很常见,其中属广西、广东、云南、湖南、江苏、浙江、福建等省产区严重受其威胁[5]。一旦被侵染,引发溃疡病,蔓延速度极快,发病严重的会造成落叶、落果,还会导致柑桔树枯死等。随着柑桔种植范围扩大,溃疡病的发生面积也增加,并对柑桔种植业构成极大威胁,危害严重。对于柑桔溃疡病的防治,大部分种植区都是以化学防治为主,以控梢等栽培措施为辅。化学防治作为农业生产中使用最多最广的一种手段,其作用效果毋庸置疑,但铜制剂作为防治溃疡病的首选药剂,长时间使用带给环境的危害也是不容忽视的。合理减少铜制剂的使用量已刻不容缓,以此不仅可以减少对生态的危害,还可以给农户降低成本增加收益。因此铜制剂替代药剂的研发与利用,为柑橘溃疡病的防治提供了更多可能。

中生菌素(zhongshengmycin)作为具有较广杀菌谱的保护性农用抗生素,是浅灰色链霉菌海南变种(Streptomyceslavendulaevarheinanensisn.var)的代谢产物[6]。此抗生素通过抑制病原菌体生长繁殖来达到抑菌的效果,并兼顾对农作物病害、昆虫、杂草等能起到抑制甚至杀死的功效。与此同时,中生菌素对植物细菌性病害的抑制作用成为替代铜制剂来防治柑桔溃疡病已初见成效。据报道,吴晓金等[7]在筛选对柑橘溃疡病菌有强烈抑制作用的化学药剂试验中,发现3%中生菌素可湿性粉剂对病菌有一定的抑制效果,其中EC50为162.89μg/mL。刘丹丹等[8]应用浑浊度法测定药剂对柑桔溃疡病原菌的毒力,利用回归分析获得毒力方程表明12%中生菌素可湿性粉剂对病原菌的抑制中浓度为3.01μg/mL。中生菌素的施用对防治病原菌有优势,又能降低对环境的破坏,减轻药剂对食品健康等方面的不良影响。但中生菌素单一大量使用也存在弊端,容易使病原菌产生抗药性,将中生菌素与作用机理存在差异的药剂进行复配可减少用药量还能扩大防治范围,并延缓抗性的发展,此措施也是农业中常见的一种。笔者研究了生物农药复配后对柑桔溃疡病菌协同毒力效果,避开了以化学农药为主要防治措施的局限性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 柑桔溃疡病原菌分离自四川省乐山市犍为县玉津镇柑桔基地(103°99′10″E,29°11′11″N)的柑桔病叶。无菌条件下用无菌水浸泡柑桔病叶,并反复冲洗3次,用纱布擦去多余水分。将擦干的叶片放入70%～75%乙醇浸泡3min,无菌水冲洗4～5次[9],再放入0.5%～1%次氯酸钠消毒1～2min,无菌水冲洗4～5次,用纱布擦去多余水分。将有溃疡病斑的病害处剪成4m×4mm小块于培养皿中,在小块叶片上加2滴无菌水,用玻璃棒研磨,至无菌水变色,形成菌液(此操作所接触的所有器皿及工具均需灭菌后使用)。采用平板划线法用无菌针蘸取菌液直接在牛肉膏琼脂培养基上划线,并多次转接单菌落反复纯化,得到有金属光泽的蜡黄色单菌落。在温室内接种到健康的柑桔叶片上,加温加湿条件下叶片上出现溃疡病斑,从而得出结论所分离的菌种为柑桔溃疡病菌。将反复纯化的菌种转接到斜面上,28℃培养48～72 h后置于冰箱保存,备用。

1.1.2 试验药剂 供试药剂38%中生菌素原药,由陕西麦可罗生物科技有限公司生产提供。复配药剂79.2%春雷霉素原药,由陕西麦可罗生物科技有限公司生产提供。试验在陕西麦可罗生物科技有限公司国家农药监测中心工程中心生测实验室进行。

1.1.3 试验培养基 牛肉膏琼脂培养基(NA培养基)：蛋白胨5g,酵母粉1g,牛肉浸膏3g,琼脂17g,水1000mL,pH为7.0,121℃高压蒸汽灭菌30min。

1.2 试验方法

1.2.1 2种单剂对柑桔溃疡病菌的毒力测定 采用平板抑菌圈法进行试验测定[10]。中生菌素和春雷霉素原药称取一定质量的样品,分别配制成1000μg/mL的母液,于4℃下低温保存待用,试验前用无菌水分别稀释成一系列浓度。先把冰箱备用的柑桔溃疡病菌用无菌水配置成1×109CFU/mL菌悬液,然后将1mL菌悬液加入到冷却至45～50℃的100mL培养基中混匀倒平板,放置20min左右,制成菌平板。取灭菌的6mm滤纸圆片置于各稀释好的药液中浸泡10min,而后靠容器内壁停滞片刻,转移到菌平板中心处[11]。每种药剂不同浓度重复4次。将放有滤纸片的平板置于28℃培养箱中培养,24～48 h测定抑菌圈直径,采用“十字交叉法”垂直测量。药剂对柑桔溃疡病菌的生长抑制率计算公式：抑制率(%)=[(处理组抑制圈直径-对照组抑制圈直径)/处理组抑制圈直径]×100%。

以供试药剂浓度的对数值为x轴,抑制率的几率值为y轴[12-13],依据两者间的线性关系计算毒力回归方程y=ax+b,并根据回归直线计算相关系数r及EC50、EC90值。

1.2.2 复配药剂的联合毒力测定 在上述1.2.1单剂毒力测定的基础之上,中生菌素与春雷霉素按体积比1：1、1：2、2：1、2：3、2：5、3：1、3：2、3：5、5：2和5：3共10个不同配比来测定二元复配药剂对柑桔溃疡病菌的抑制率,复配药剂的终浓度见表1。

表1 不同杀菌剂单剂及复配药剂的浓度

采用混剂共毒系数法(co-toxicitycoefficient,CTC),以CTC值的大小来评判二元复配药剂的联合毒力作用。共毒系数的计算公式如下：

首先通过实验及软件进行数据分析,得出测试药剂的毒力方程、EC50、EC90以及95%置信限,进而计算毒力系数：

理论毒力指数(TTI)=a的毒力指数×a在混剂中的含量(%)+b的毒力指数×b在混集中的含量(%)

式中：EC50为中生菌素单剂或春雷霉素单剂或二者混配的实测有效抑制中浓度,μg/mL;a为中生菌素单剂;b为春雷霉素单剂。

混剂的共毒系数(CTC)值在小于80时,判定为二者拮抗作用;在80～120之间时,判定为相加作用;在大于120时,判定为增效作用[14];大于200时,为明显的增效作用。

2 结果与分析

中生菌素单剂对柑桔溃疡病菌的抑制中浓度较春雷霉素单剂防效具有优势,其中中生菌素EC50在41.3179μg/mL,春雷霉素EC50在63.9440μg/mL。但在两者复配情况下春雷霉素表现的更具有优势,随着春雷霉素的增加,EC50降低,药剂敏感度增强,而中生菌素表现正好相反。从表2可见,两者大部分复配组合物均具有相加作用;当中生菌素与春雷霉素按体积比2：1、3：1、5：2复配时,两者具有拮抗作用,共毒系数分别为73.86、76.32、75.48,在农业生产中不宜采用此复配比例;当中生菌素和春雷霉素体积比2：5复配时,共毒系数最大,为126.99,表明两者复配具有增效作用。因此,中生菌素与春雷霉素复配可有效防治柑桔溃疡病菌,可替代铜制剂等化学药剂,为田间柑桔溃疡病菌的化学制剂抗药性治理奠定良好的基础。

表2 复配药剂对柑桔溃疡病菌的毒力比较

3 讨论

柑桔溃疡病是世界范围的检疫病害,1999年陈灵敏等[15]报道防治柑橘溃疡病药剂以波尔多液防效最佳,防效在94.91%,其次47%加瑞农可湿性粉剂、绿乳铜和消病灵,防效分别在90.39%、77.70%和72.80%,表明杀菌剂中防治溃疡病以铜制剂较为有效。后期铜制剂的大量、大范围使用增强了病原菌的抗药性,同时随着最后一个农用链霉素登记证件到期,不再续展,市场份额被其他细菌性防治药剂替代占据,因此生物安全性新药剂的研发与应用有一定必要性。孙慧敏等[16]试验结果表明,6%大蒜素EC对溃疡病具有较好防效,并可作为防治溃疡病生产有机或绿色脐橙使用。宋晓兵等[17]研究了25%春雷霉素·叶枯唑新型复配药剂对柑桔溃疡病菌的防效及对柑桔的安全性,结果表现为25%春雷霉素·叶枯唑对柑桔溃疡病田间防治效果能达到80%以上。Luana等[18]研究了查尔酮BC1和T9A对柑桔溃疡病菌的抑菌活性,结果显示BC1和T9A在20～40μg/mL浓度范围内可有效抑制病原菌活性。应用过程中,药剂应择优轮换使用,降低耐药性;或选择施用适宜的复配制剂,即可有效延缓病害对药剂的抗性发生,扩大抗菌谱,还有助于打造生态友好化发展趋势;也可以在药剂中加入助剂,具有减少用药量、增强药效以及延缓抗药性的产生等优点[19]。此外,种植户要有意识地树立起科学种植的意识,对防治措施严加把控,保障柑桔的产量与品质,从而实现增产增收目标[20]。

4 结论

杀菌剂复配表现的联合毒力作用分为3种,分别是增效、相加与拮抗作用,实际生产上会更倾向于具有增效作用的杀菌剂配比比例进行复配。本试验表明,选用春雷霉素与中生菌素进行复配,春雷霉素是一种小金色放线菌所产生的农用抗生素,医农兼用菌剂,有预防和防治双重作用,具有较强的内吸性、渗透性,高效、广谱、低毒的优点,两者复配防效多表现为相加或增效作用,增强了中生菌素对柑橘溃疡病菌的生物活性。因此将中生菌素与春雷霉素进行复配协同防治柑桔溃疡病菌是可行的,为下一步田间试验奠定基础。但田间具体防效仍需进一步的试验进行验证,同时复配药剂的田间使用防治技术还待进一步探究。