萝卜种质亲缘关系的分子标记分析

刘辰　付卫民　刘贤娴　徐文玲　郭栋　王淑芬

关键词：萝卜：亲缘关系：分子标记；遗传多样性：聚类分析

中图分类号：S631.101 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023） 03-0022-08

萝卜（Raphanus sativus L.）属十字花科萝卜属，是一种非常重要的蔬菜作物，不仅营养价值丰富，且具有广泛的用途，其肉质根可作为蔬菜鲜食和制干食用，叶和种子皆可入药，食用、药用和保健价值较高。大、中型萝卜主要分布在亚洲地区，尤其是中国、日本和韩国等。我国作为萝卜的起源地之一，产区分布很广，几乎每个地区都有种植，而且拥有世界上最为丰富的种质资源。萝卜的类型十分多样，可以根据叶形、根形、皮色肉质色、栽培季节、用途等进行分类，目前我国国家蔬菜种质资源库中保存的萝卜种质资源已超过2000份。

种质资源是开展育种工作的基础，只有充分了解萝卜种质资源的遗传多样性，才能更有效地纯化和利用种质开展品种选育工作。早期对萝卜种质遗传多样性的分析方法是建立在形态水平上的，一般根据叶型、根形、根皮色、肉质色、抗逆性、抗病性、风味等可以测量、易于观察的特征进行分类。这类方法虽然相对简单、易于操作，但存在形态标记数量较少且容易受环境条件、观察者主观因素等影响。之后，国内学者采用生理生化水平的技术方法对萝卜种质资源进行分析，如用同工酶、硫代葡萄糖苷等指标作为标记对来源于国内外的种质进行分类。这类方法具有标记指标数量多、不易受环境影响等优点，已被广泛用到很多物种的遗传多样性研究中。

近年来，随着分子生物技术的不断发展，大量的分子标记被开发出来，由于具有成本低、重复性好、标记数量多等优点，越来越多的种质遗传多样性分析开始采用分子标记。在萝卜的相关研究中，较早应用的是RAPD、AFLP等类型的标记，但随着标记数量的增多和种类的丰富，SSR、ISSR等更易于操作的标记已成为目前采用较多的标记类型。国内外已有利用分子标记技术对萝卜种质资源亲缘关系进行分析的报道，但多是对不同种质进行分类或是对某一特定类型种质进行的分析，而且选用的种质类型各不相同，材料数量也从几份到几十份不等，因此得到的结果并不完全一致。本研究用来源于国内外不同国家和地区的108份萝卜种质为试材，对分布在整个基因组上的118个标记进行了筛选，获得56个多态性好的标记并用于分析萝卜种质的亲缘关系，以期为更好地评价种质资源、了解其遗传进化关系进而指导品种选育工作提供数据支持。

1材料与方法

1.1试验材料及引物

1.1.1试验材料 本研究选用的108份不同类型萝卜种质（表1），包括绿皮绿肉类型30份、绿皮淡绿肉类型6份、绿皮白肉类型3份、心里美类型6份、红皮白肉类型19份（其中2份为穿心红类型）、浅红皮白肉类型1份、黑皮白肉类型1份、白皮白肉类型34份、红皮白肉类型樱桃萝卜6份、白皮白肉类型樱桃萝卜2份，均由山东省农业科学院蔬菜研究所萝卜课题组提供。所有种质的种子经催芽后，在铺有滤纸的小培养皿中培养（23℃，光周期为16 h光照/8h黑暗），待子叶完全展开时取样，每份材料随机从5个单株上摘取嫩叶，保存于-20℃冰箱备用。

1.1.2试验所用引物 本研究所用引物全部来源于萝卜的参考基因组网站（http：//radish-ge-nome.org/），其中SSR引物27对，InDel引物80对，IBP引物11对。引物用无菌水稀释到10μmol/L，-20℃保存备用。

1.2 DNA提取

采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA，DNA提取质量通过1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，DNA浓度利用紫外吸收法进行检测，根据检测的浓度情况用ddH，0稀释至10ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。

1.3 PCR扩增及检测

本研究所用PCR反应体系总体积为10μL：2×Taq PCR Mix 5μL，正反向引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH20 3μL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min;94。C变性30 s，55。C退火30 s，72℃延伸1min，25个循环：72℃充分延伸5 min;4℃保存。扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。选择条带清晰、多态性好的标记进行数据统计及后续分析。

1.4数据统计分析

根据电泳检测结果，选择清晰且容易分辨的条带进行统计，有条带记为1，没有条带记为0，缺失条带记为9，在Microsoft Excel 2013中记录统计结果，建立所有材料的数据矩阵。使用DataFor-mater 2.7软件对所建矩阵进行数据转换，利用POPGENE 1.31软件计算观测等位基因数（N_a）、有效等位基因数（N_e）、Shannon多态性指数（I）和Nei遗传多样性指数（H），采用PIC_CALC 0.6軟件计算各标记的多态信息量（ PlC）。

根据NTSYSpc 2.10软件要求的格式将原始矩阵数据进行转换，并通过该软件计算出所有种质材料的遗传相似系数，利用SHAN程序中的Tree plot绘制关于材料遗传距离的UPGMA（算术平均非加权配组法）聚类树状图。利用Origin2019b程序进行主成分分析（PCA）。

2结果与分析

2.1分子标记筛选分析

将所有标记在108份萝卜种质中进行扩增，根据扩增结果挑选出带型清晰、多态性好的分子标记56个。这56个标记在萝卜基因组的每条染色体上都有分布，其中，8号染色体上的标记数最少，只有3个；5号染色体上最多，有11个标记（图1）。

56个标记扩增出的条带总数为130条，平均每个标记2.3条：PIC值在0.29～0.55之间，高于0.50的标记有3个，分别为RsIBP18、RsSSR109和RsIBP17：扩增出条带最多的标记为RsSSR109，扩增出5条带；43个标记（76.8%）只扩增出2条多态性条带，分别有9个和3个标记扩增出3条和4条多态性条带，只有1个标记扩增出5条多态性条带（表2）。

通过POPGENE 1.31软件分析，108份萝卜材料的观测等位基因数平均值为2.3214，有效等位基因数平均值为1.8643，有效等位基因的比例为80.31%，Nei遗传多样性指数平均值为0.4573，Shannon多态性指数平均值为0.6766（表3）。

2.2遗传多样性分析

基于上述筛选得到的56个标记，计算出108份萝卜种质间的遗传相似系数，遗传距离的变化范围为0.54～0.99，利用SHAN程序和UPGMA方法进行聚类分析，结果（图2）显示，在相似系数为0.61处，可将108份萝卜种质分为4大类，第1类主要包括大、中型的绿萝卜、白萝卜和红皮白肉的萝卜材料，共94份；第2类包括6份绿皮红肉的心里美类型种质材料：第3类仅为1份黑皮白肉的黑萝卜；第4类则是小型的樱桃萝卜类型，包含7份材料。

进一步分析，在相似系数为0.677处可将第1类的94份材料分为8个亚类。A亚类包含材料最多，共有42份，约占供试材料总数的45%。在相似系数为0.71处，可进一步将A亚类分为2个组，第1组包括27份材料，均为绿萝卜类型（ 21份为绿皮绿肉、5份为绿皮淡绿肉、1份为绿皮白肉），除来源于乌兹别克斯坦的1份材料根形为圆形外，其余材料肉质根均为长圆柱、圆柱或短圆柱形，均来源于国内，以山东为主：第2组的组成较为复杂，15份材料中有9份为红皮白肉、5份为白萝卜、1份为绿萝卜，根形以圆柱和长圆柱形为主，来源地也比较分散。B亚类共9份材料，除1份白萝卜来源于日本，其余均为国内的绿萝卜种质，根形包括圆形、短圆柱、圆柱和长圆柱。C亚类的3份材料均为国内的绿萝卜，根形圆柱或长圆柱形。D亚类为国内的红皮白肉萝卜，全部是圆形。E亚类是2份山东的红皮白肉的圆萝卜材料。F亚类的2份材料是国内的白萝卜，肉质根圆柱形。G亚类除了1份浅红皮白肉的国内种质，其余均为白萝卜，来源于国内、韩国、日本和巴基斯坦，根形包括短圆柱、圆柱、长圆柱和细长圆柱形。H亚类是4份来自日本的细长圆柱形的白萝卜材料。

利用Origin 2019b对108份种质进行主成分分析，结果（图3）与UPGMA聚类分析结果基本一致，PC1、PC2和PC3所能解释的遗传变异分别为11.0%、9.3%和6.0%。值得注意的是，第1类中红皮白肉的圆形种质昆红19与其他种质距离较远，第2类中QY-3和QX-123这两份圆柱形的心里美种质与同类群的圆形心里美种质距离较远。

3讨论

了解种质的遗传多样性及其亲缘关系有利于更好地对其进行评价鉴定，并可为育种研究提供数据支持。相较于形态标记和同工酶标记等分析方法，分子标记具有操作简便、周期短、准确度更高等优点。已有研究发现，不同类型的分子标记在分析种质遗传距离时存在一定差异，采用多种标记综合分析可以使结果更加准确、可靠。本研究以分布在9条染色体上的118个分子标记在108份萝卜种质中进行筛选，得到56个多态性好的标记，包括39个InDel标记、11个SSR标记和6个IBP标记，PIC值在0.29～0.55之间，属于中高度多态性标记，符合筛选高质量分子标记的条件。这些标记在每条染色体上都有分布，以5号染色体上最多（11个），8号染色体上最少（3个），这与每条染色体上开发出的标记数量有很大关系。进一步分析结果表明，这些标记的观测等位基因数平均为2.3214，有效等位基因数平均为1. 8643，有效等位基因的比例为80.31%，与之前报道的利用ISSR和SSR标记分析的结果相似：Nei基因多样性指数的平均值为0.4573，Shannon多态性指数的平均值为0.6766，反映出本研究供试萝卜种质材料具有较高的遗传多样性。

在种质分类方面，形态标记与分子标记具有一定的一致性。本研究供试的108份萝卜种质被分为4类，第1类主要是绿萝卜、白萝卜、红皮萝卜，第2类是心里美萝卜，第3类是黑萝卜，第4类是红皮和白皮的樱桃萝卜。心里美材料、黑萝卜材料和樱桃萝卜材料各自聚为一类，说明这三种类型材料间亲缘关系较远。孔秋生等利用RAPD标记对56份种质的聚类分析結果也将1份心里美材料、1份黑萝卜材料、8份樱桃萝卜材料各自聚为一类，与本研究结果一致。另外，本研究选用的108份材料中有6对雄性不育系及其保持系，聚类分析结果显示，这6对材料中的01-11A/B、ZH-230A/B、TH-24A/B和KR-125A/B都与相同皮色、肉质色的材料聚类在一起，并且雄性不育系及其对应的保持系亲缘关系最近；14青A/B和64A/B虽然没有与大多皮色、肉质色相同的材料聚在一起，但其不育系及保持系之间的亲缘关系也是最近的。这也证明了本研究结果的可靠性。

关于决定萝卜种质亲缘关系的关键因素，已有研究得到的结论并不完全一致，如Pradhan等利用RAPD标记分析发现，与按照地理起源进行分类相比，按照表型对萝卜进行分类更可靠：孔秋生等通过AFLP标记分析发现，萝卜肉质根的根皮色是我国国内种质资源分类的重要参考因素；周娜等的研究则表明，与种质资源亲缘关系最密切的不是表型指标，而是材料的来源地，其次才是根肉色。在本研究中，前3类是大中型萝卜种质，其分类与肉质根皮色、肉质色关系密切，第1类中的8个亚类也主要是皮色、肉质色相同的种质聚类较近：进一步分析第1类的8个亚类可以发现，在确定皮色、肉质色的前提下，种质聚类也与根形有一定的联系。A亚类和C亚类的绿皮绿肉种质主要是长圆柱和圆柱形，B亚类主要是圆柱、短圆柱和圆形；A亚类中的红皮白肉种质主要是长圆柱、圆柱和短圆柱形，在D和E亚类中的则全部是圆形；F亚类中的2份白皮白肉萝卜是圆柱形，G亚类中的白箩卜主要是长圆柱形，H亚类中的是4份细长圆柱形种质。此外，第2类的6份心里美种质也是按圆柱形和圆形分别聚在了一起。前人研究中也有类似报道，即扁圆形和长圆柱形的白皮白肉种质分别聚类。但将本研究所用种质的来源地与聚类结果进行联系，并没有发现明显的规律。对中、日、韩三个白萝卜主产国的种质分析发现，韩国种质全部聚在第1类的G亚类，日本种质全部在G亚类和H亚类，而中国的白萝卜种质在A、B、F、G四个亚类中都有分布，这在一定程度上反映了我国的种质资源更为丰富。Kobayashi等的研究表明，韩国种质均与中国种质聚在一起，日本种质虽与中、韩种质有所重叠，但差异较大，这与本研究结果有一定的一致性。

4结论

综合本研究结果，萝卜种质亲缘关系与肉质根皮色、肉质色的联系较密切，其次为根形。基于形态标记的分类虽与分子标记分类具有较高的关联性，但由于受主观判断、生长环境等因素影响，分类结果并不完全一致。因此，在实际育种工作中，育种者要想快速、准确地评价种质材料以充分利用杂种优势配置组合，应当在丰富的育种经验基础上适当采用分子标记进行辅助分析。