基于植物DNA条形码 rbcLa 序列的日本条螽食谱分析

王 慧,赵一铮,黄慧敏,周志军

(河北大学生命科学学院,河北省动物系统学与应用重点实验室,河北保定 071002)

植物与植食性昆虫占据地球半数以上物种种类(Futuyma and Agrawal, 2009),是陆生生态系统中最重要的组成部分。绿色植物是生态系统中最重要的生产者(McClenaghanetal., 2015),为昆虫提供食物、躲避天敌和繁衍生息的场所(Loaizaetal., 2008)。植物的防御行为与昆虫的取食密切相关,植物进化出种类繁多的次生代谢产物,对昆虫的食物选择产生重要影响。同时,昆虫也为植物运输种子和传递花粉,被子植物的多样性被认为与昆虫的取食密切联系。昆虫形态及生活史变化可能是促使植物分化的重要动力(Marquis, 2004)。正如Ehrlich和Raven提出的植食性昆虫与植物的相互作用,造就了现今陆地生物多样性的产生。植物含有植食性昆虫生长发育所需的全部营养物质,包括碳水化合物、氨基酸、甾醇、磷脂、脂肪酸、维生素、矿物质、微量元素和水等(Chapman, 1998; Schoonhovenetal., 2005)。

常用的植食性昆虫食性分析方法包括:取食行为直接观察法和肠道内容物及粪便显微鉴定法。取食行为直接观察法耗时费力,只能对少量个体的取食情况进行定性研究(Gordonetal., 1995);不适用于活动范围较广、夜行性或警觉性较高的昆虫(Barnettetal., 2010; Bakeretal., 2014);对那些复杂环境中存在多种空间上不分离的潜在被取食对象,很难准确识别昆虫取食的植物种类(Valentinietal., 2009)。鉴于上述缺陷,逐渐形成多种基于粪便或肠道内容物的食性分析方法(Moreno-Black, 1978; Van, 2000; 刘刚等, 2018):(1)显微鉴定法(Microhistological method),对粪便或肠道内容物中的植物表皮碎片进行形态学显微鉴定,对研究者形态学专业知识要求较高(Holecheketal., 1982; Mclnnisetal., 1983),对形态相似的近缘种鉴定效率较低;(2)饱和烷烃指纹法(Alkane fingerprint method),根据每种植物独特的饱和烷烃浓度模式,能较好地分析和预测动物摄食量,但难以确定食物组成(Dove and Mayes, 1996);(3)近红外反射光谱法(Near infrared spectroscopy, NIRS),通过扫描食性样品的近红外光谱得到食物的有机分子光谱特征,容易受颗粒大小和均匀性影响使分析结果产生偏差(Foleyetal., 1998; Kanekoetal., 2006)。上述几种食性分析方法在进行定量分析时均存在一定偏差。

近年来,随着植物DNA条形码研究的深入,为有效鉴别植食性昆虫取食的寄主植物种类、解析二者间的营养关系提供了新方法。目前,叶绿体matK、trnH-psbA以及rbcL组合被认为是理想的植物DNA条形码选择。Symes等(2019)以matK、trnH-psbA和rbcLa3个基因片段对螽斯食性进行了研究。DNA条形码在植食性灶蟋Gryllodeshebraeus研究结果表明取食后12 h内消化道中的食物均可被检测到(Mathesonetal., 2008)。Höss等(1992)首次将叶绿体rbcl基因片段用于植食性动物食性分析。McClenaghan等(2015)利用叶绿体rbcLa基因片段比较了蝗科4种蝗虫取食的植物种类。目前,叶绿体rbcL基因片段认可度最高,GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)数据库收录叶绿体rbcL基因序列287 752条(截止2021年11月1日);而BOLD(Barcode of Life Data System, http://www.boldsystems.org)数据库则以叶绿体rbcL&matK序列作为植物分子鉴定的标准组合。

螽斯科是直翅目物种多样性最高的科,作为鸣虫具有重要的生态和经济价值。对植食性螽斯取食的植物种类进行鉴定,不仅有助于了解其在生物群落中的功能(Duffyetal., 2007),而且对于丰富植食性昆虫-植物间的协同进化理论具有重要意义。日本条螽Ducetiajaponica隶属于直翅目Orthoptera螽斯科Tettigoniidae,广泛分布于东洋界、澳洲界部分区域,在我国除西北部分地区外的多数地区均有分布(Ciglianoetal., 2021)。日本条螽存在棕色和绿色两种色型,在野外常见于低矮乔木、灌木、草丛,在城区绿地大量发生。白天多隐藏在植物叶片背面或草丛中,傍晚爬至灌木上取食。Suetsugu和Tanaka(2014)发现日本条螽若虫频繁访问并取食兰科Habenariasagittifera花粉和花药帽,认为可能存在直翅目-兰花授粉互惠共生的进化途径。目前,国内外学者已对日本条螽的鸣声特征(杨培林等, 2000; 石福明等, 2003; Helleretal., 2017)、线粒体基因组序列(刘菲, 2017)、种群遗传结构及谱系地理学(Zhouetal., 2021)进行了研究。为探明造就日本条螽地理分布格局及其能够在城区绿地大量存在的原因,本研究利用叶绿体rbcLa基因片段对城区绿地和城郊荒地两种生境中取食的植物种类进行了分子鉴定。

1 材料与方法

1.1 样品采集与肠道内容物DNA提取

本研究所用日本条螽标本于2021年8-9月夜晚(20∶00-22∶00)采集自河北保定城区军校广场、河北大学五四路校区、马庄荒地(图1)。采集到的日本条螽标本立即置于盛有足量无水酒精的冻存管中带回实验室。次日上午纵向剪开日本条螽腹壁,轻拉头部取出完整消化道。纵向剪开消化道壁,收集内容物并在液氮中充分研磨。使用TIANGEN新型植物基因组提取试剂盒(DP320),依据操作说明进行DNA提取,并置于-20℃冰箱中保存备用。

图1 日本条螽生境图Fig.1 Habitus of Ducetia japonica 注:A,城区绿地;B,城郊荒地;C,夜晚采集标本照;D,标本生态照。Note: A, Urban green space; B, Suburban wasteland; C, Collecting specimen photos at night; D, Specimen ecological photos.

1.2 叶绿体 rbcLa 基因片段PCR扩增及测序

叶绿体rbcLa基因片段的扩增引物为:rbcLa-F(ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC)和rbcLa-R(GTA AAA TCA AGT CCA CCR CG)(Symesetal., 2019)。PCR反应体系包括:2×Premix TaqTM25 μL、上下游引物各5 μL、DNA模板3 μL、超纯水补足50 μL。反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃再延伸10 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送金唯智公司进行双向测序。

1.3 测序结果拼接与数据库搜索鉴定

双向测序结果使用DNAstar软件包中的SeqMan拼接。通过BOLD、Genbank数据库进行同源搜索,以确定每个日本条螽样本取食的植物种类。本研究最佳匹配序列与目标序列覆盖度(Coverage)和一致度(Identity)均大于95%时认为检索结果有效。鉴定原则参考邵昕宁等(2019)修改如下:(1)当BOLD和GenBank数据库最佳匹配结果一致,且与单一物种比对一致度≥99%时,记为该物种;与多个物种比对一致度均≥99%时,记为涵盖这些物种的最低分类单元。(2)比对一致度介于95%与99%之间,且符合物种分布记录时,同样记为该物种。(3)比对一致度介于95%与99%之间,但仅对应单一无分布记录的物种;或比对一致度<95%时,认为无法确定具体种类,记为属级未定种。(4)当两个数据库最佳匹配结果不一致时,首先根据采集点本底信息及物种分布记录排除不符合物种;如果仍无法排除则记为涵盖这些物种的最低分类单元。将军校广场和河北大学校园归为城区绿地,马庄归为城郊荒地两种生境进行比较。

2 结果与分析

2.1 日本条螽在城区绿地中取食的植物种类

从38头采自城区绿地的日本条螽肠道内容物中成功扩增并测得叶绿体rbcLa基因序列,经鉴定发现日本条螽在城区绿地中取食的植物种类涵盖6科7种,以18头取食卫矛科Celastraceae的冬青卫矛Euonymusjaponicus占据优势(47.37%)。其余20个个体由多至少依次为:茜草科Rubiaceae的茜草Rubiacordifolia(7头),夹竹桃科Apocynaceae的鹅绒藤Cynanchumchinense(5头),茜草科Rubiaceae的鸡矢藤Paederiascandens(3头),木樨科Oleaceae的迎春花Jasminumnudiflorum(2头),大麻科Cannabaceae的葎草Humulusscandens(2头),蔷薇科Rosaceae蔷薇属Rosa植物(1头)(表1,图2)。

2.2 日本条螽在城郊荒地中取食的植物种类

从37头采自城郊荒地的日本条螽肠道内容物中成功扩增并测得叶绿体rbcLa基因序列,经鉴定发现日本条螽在城郊荒地中取食的植物种类涵盖5科6种,以30头取食大麻科Cannabaceae的葎草Humulusscandens占据绝对优势(81.08%)。其余7个个体由多至少依次为:唇形科Labiatae的紫苏Perillafrutescens(3头),葫芦科Cucurbitaceae的南瓜Cucurbitamoschata(1头)和丝瓜Luffaaegyptiaca(1头),菊科Compositae的向日葵Helianthusannuus(1头),黎科Chenopodiaceae的黎Chenopodiumalbum(1头)(表2,图2)。

续表1 Continued table 1

续表1 Continued table 1

表2 城郊荒地中日本条螽取食的植物种类

续表2 Continued table 2

图2 城区绿地(A)和城郊荒地(B)中日本条螽的食物构成Fig.2 Diet composition of Ducetia japonica in urban green space (A) and suburban wasteland (B)

3 结论与讨论

昆虫食性分析时由粪便和肠道内容物中提取的DNA均存在一定程度的降解,并含有PCR抑制剂影响扩增和测序成功率(Bradleyetal., 2007)。Symes等(2019)研究发现3个植物DNA条形码片段(rbcLa、psbA和matK)在前半夜(23∶00-01∶00)捕获的体型较小的螽斯中扩增成功率较高;此外,螽斯肠道内容物颜色与扩增和测序成功率密切相关:无色+黄色+绿色+黄褐色组的成功率>30%,无色组的成功率约60%,棕色+橙色+红色+绿棕色组的成功率极低。日本条螽为中型螽斯,肠道内容物为绿色。植食性动物在不同的栖息环境中,其食物的可获得性和多样性存在明显不同(Cristo’bal-Azkarateetal., 2007)。日本条螽在两种生境中取食的植物种类有一定的选择性,但也与食物的可获得性有关。城郊荒地的植物物种多样性远高于城区绿地,但其对取食植物的偏好更为明显,81.08%的日本条螽个体取食大麻科的葎草。城区绿地中,除47.37%个体取食卫矛科的冬青卫矛外,取食其余6种植物的比例从2.63%至18.42%不等,偏好性并不明显,可能是其适应城区绿地植物组成的结果。最佳觅食理论认为,动物在食物资源减少时,会逐步向泛食性转变。

本研究通过对新采集的日本条螽肠道内容物进行DNA提取、rbcLa基因片段PCR扩增及测序,通过在GenBank和BOLD数据库中进行搜索比对发现日本条螽至少取食10科、13种植物。结果表明,基于肠道内容物DNA进行植物DNA条形码rbcLa基因片段扩增、测序,并利用GenBank、BOLD等公共数据库资源可以对植食性昆虫取食的植物种类进行快速鉴定和食性分析。GenBank数据库中收录的部分序列可能存在序列、对应物种信息错误。植物DNA条形码研究为利用BOLD数据库进行植食性昆虫食性分析的效率和精度得到极大提升。同一条序列可能与多个物种高度匹配,在缺乏足够的区域物种本底信息时,只能将其归类为包含这些物种的上一级分类单元。通过构建本地潜在食源DNA条形码rbcL序列数据库可显著提高食性分析时的分类精度。

昆虫是城市生物多样性的重要组成部分。探究城市化进程对城区昆虫多样性的影响,有助于更好地保护昆虫多样性。日本条螽能够占据广泛的分布范围,并在城区绿地大量发生,可能与其广谱的取食对象密切相关。为避免竞争,同域分布的近缘种可能会进化出不同的觅食策略,选择不同的微生境或取食不同的食物。基于植物DNA条形码的食性研究,为探究行踪隐秘的植食性螽斯与栖息地植物间的协同进化关系提供了新的手段,有助于揭示近缘种的同域共存机制。