miRNA-647在乳腺癌中的作用研究

高 宇 金春明 邓 梦 丁鑫哲 张 航 徐春艳

1.牡丹江医学院第一临床医学院，黑龙江牡丹江 157000；2.牡丹江医学院附属红旗医院医学检验科，黑龙江牡丹江 157000；3.黑龙江省牡丹江市肿瘤医院病理科，黑龙江牡丹江 157000

乳腺癌（breast cancer，BC）占所有女性癌症病死人数的15%～20%[1]。BC 与关键的癌症特征有关，包括持续增殖、逃避凋亡、增强转移等。BC 的分子机制仍有待研究，迫切需要诊断治疗BC 的有效分子靶点。微小RNA（microRNA，miRNA）在调节基因表达和细胞过程中起关键作用[2-3]并与癌症患者的诊断、治疗相关。有研究发现miR-647 对胃癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤类疾病能够起到显著的抑制作用[4-5]，提示miR-647 可能是广泛存在的抑癌基因，在癌症治疗中起关键作用。然而miR-647在BC 中的作用还不清楚，本研究对miR-647 在BC组织和细胞中的表达水平进行测定分析，对比其在BC 组织和癌旁组织，BC 细胞和正常细胞的差异性；同时探讨miR-647 过表达对BC 细胞增殖能力、迁移能力、凋亡和周期的调节作用，研究结果表明，miR-647 在BC 组织及其细胞系中可能发挥着抑制癌细胞增殖和迁移的作用，这将会是未来临床治疗BC 的一个全新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本 收集2021 年6 月至2022 年9 月牡丹江市肿瘤医院的28 例BC 患者的BC 组织和癌旁组织。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.1.2 细胞 BC 细胞系（MCF-7、MB-MDA-231、SK-BR3）和正常细胞系（MCF-10A）均购于中国科学院细胞研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将MCF-7、MDA-MB-231 两种细胞置于MEM 培养基中进行孵育。将SK-BR3、MCF-10A两种细胞置于DMEM培养基中进行孵育。

1.2.2 细胞转染 将MCF-7 细胞铺于6 孔板中并培养，分别转染人工合成miR-NC（阴性对照序列）、miR-647 mimics 模拟物，命名为miR-NC 组、miR-647 mimics 组。

1.2.3 qRT-PCR 检 测miR-647 表 达 水 平 运 用qRT-PCR 扩增待检测基因并分析数据。相对表达量以2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 CCK-8 实验 在24、48、72、96 h 时，每孔加入一定量CCK-8 检测液并测定其在波长为450 nm处的OD 值。

1.2.5 划痕实验 长满细胞后沿中轴划“十”字线，依次在0、24、48 h 时用显微镜进行拍照，按照迁移速率绘制柱形图。

1.2.6 细胞凋亡实验 每管中加入1×Binding Buffer 工作液，用流式细胞仪检测。

1.2.7 细胞周期实验 每管加入染色工作液置于无光条件下进行水浴处理，用流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法

实验重复三次，用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（± s）表示，两组间比较采用t检验，多组间采用单因素方差分析，不符合正态分布的计量资料用中位数及四分位间距[M（P25，P75）]表示。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-647在BC组织中表达情况

采用qRT-PCR 技术检测BC 组织（n=28）和癌旁组织（n=28）中miR-647 的表达水平，结果表明miR-647 在BC 组织中的表达水平明显低于癌旁组织，差异有统计学意义[1.00（0.61，1.24）vs.0.50（0.30，0.72），P＜ 0.001]。见图1。

图1 miR-647 在癌旁组织和乳腺癌组织中相对表达水平比较（＊＊＊表示P ＜ 0.001）

2.2 miR-647在不同细胞系中的表达情况

用qRT-PCR 检测MCF-10A 和MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR3 中miR-647 的表达。结果表明与MCF-10A 相比，miR-647 在MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR3 中的表达均降低。并且在MCF-7 细胞中降低更为明显，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。所以选择MCF-7 细胞进行研究。见图2。

图2 miR-647 在不同细胞系中的表达差异情况（＊＊表示P ＜ 0.01）

2.3 miR-647对BC细胞增殖和迁移的影响

为了调节miR-647 的表达，转染miR-647 模拟物到MCF-7 细胞中，发现miR-647 mimics 组与miR-NC组相比，miR-647 的表达显著增加，差异有统计学意义[（1.00±0.01）vs. （36.54±10.08），P=0.008]（图3A）。CCK-8 实验结果表明与miR-NC 组相比，miR-647 mimics 组显著抑制细胞增殖，差异有统计学意义[（1.51±0.08）vs. （0.86±0.03），P=0.001）]（图3B）。细胞划痕结果表明与miR-NC 组相比，miR-647 mimics组细胞迁移能力明显下降，对细胞迁移过程产生了一定的抑制作用，差异有统计学意义[（0.39±0.02）vs. （0.23±0.04），P=0.011）]（图3C）。

图3 miR-647 对MCF-7 细胞增殖和迁移的影响

2.4 miR-647对BC细胞凋亡和周期的影响

细胞凋亡实验结果显示，与miR-NC 组相比，miR-647 过表达促进MCF-7 细胞凋亡，差异有统计学意义[（0.87±0.26）%vs. （2.89±0.27）%，P＜ 0.0001）]（图4A）。细胞周期实验结果显示，相对于miR-NC 组，miR-647 mimics 组G0/G1 期比例上升，S 期比例下调，抑制细胞周期进程从而抑制细胞增殖，差异有统计学意义[（38.37±0.21）%vs.（48.67±2.16）%，P=0.005）]（图4B）。

图4 miR-647 对BC 细胞凋亡和周期的影响

3 讨论

BC 是常见的癌症之一，是一种严重影响妇女健康的致死性疾病。传统治疗方法为外科手术，化疗和放疗等，但是治疗效果仍有欠缺。因此寻找有效的治疗靶点，探究其在BC 中的作用才能更有效的诊断治疗BC。在癌症中，失调的miRNA表达可以检测肿瘤的发展情况，包括细胞增殖，迁移，凋亡等。一些miRNA 可作为抑癌基因，而另一些则作为癌基因[6]。有研究表明一些miRNA 在BC 中异常表达，如miR-21、miR-155、miR-let-7b-5P 等[7-9]。Qin 等[10]发现，在胶质瘤中，miR-647 通 过靶向HOXA9 对细胞增殖和迁移起到一定的抑制作用。在非小细胞肺癌中，miR-647 对癌细胞的生物学过程起到一定的抑制作用[11]。然而另有研究显示，miR-647 在结肠癌组织中表达上调[12]。在肝癌细胞中miR-647 的表达水平高于正常细胞并且介导的PTPRF 表达下调影响HCV-huh 7.5 细胞中的Erk 信号通路[13]。这些结果表明，在不同类型的癌症中，miR-647 调控的分子靶点和网络不同，可以作为癌或抑癌基因参加调控。

为了探究miR-647 在BC 中的表达情况和功能作用，首先本研究采用qRT-PCR 检测了miR-647 在BC 组织中的表达情况，结果显示miR-647 在BC组织显著下调。为了进一步了解miR-647 对BC细胞的影响，检测miR-647 在BC 细胞中的表达水平，结果显示miR-647 在BC 细胞中显著下降，与其在BC 组织中的结果相一致。从而证明miR-647在BC 中可能为抑癌基因。有发现胃癌患者的血清miR-647 表达显著低于正常人，miR-647 过表达对胃癌细胞的增殖和转移等生物学过程产生一定的抑制作用[14]。此外，还有研究发现miR-647 调控血清反应因子/肌球蛋白重链9（SRF/MYH9）信号轴抑制胃癌侵袭和转移[15]。然而miR-647 在BC 细胞中的生物学作用还不清楚，通过CCK-8 实验和划痕实验发现，miR-647 过表达抑制BC 细胞增殖和迁移。运用流式细胞术进一步证明miR-647 过表达可以促进细胞凋亡。细胞周期实验也发现了miR-647 过表达使细胞从G0/G1 期到S 期受到了阻滞作用，进而抑制BC 细胞增长。综上所述，国内外相关文献报道了miR-647 在多种癌症中都发挥调控作用，因此本研究基础稳固，且本研究通过多项实验发现miR-647 可抑制乳腺癌细胞的恶性特征，这些结果表明miR-647 可能在BC 中起抑癌作用并且在BC 基因靶向治疗中具有一定的作用，可为临床提供BC 治疗的新靶点。本研究未进一步探究miR-647 下游靶基因及信号通路，猜测miR-647 可能在BC 的分子机制中具有一定的研究意义。