大豆异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

徐建国 谷荣辉 李 晒 杜宏洋 李 丽 王博文 秦志文 陶泉坊 赵士弟

1.蚌埠医学院临床医学院，安徽蚌埠 233030；2.蚌埠医学院影像学院，安徽蚌埠 233030；3.蚌埠医学院心脑血管基础与临床重点实验室，安徽蚌埠 233030；4.蚌埠医学院病理生理学教研室，安徽蚌埠 233030

脑缺血性损伤主要是因为供给脑部的血管发生动脉粥样硬化从而导致的脑供血不足现象，临床上缺血性脑卒中占脑血管病的80% 左右[1-3]。对于脑缺血性疾病的治疗手段一方面是采取溶栓治疗，另一方面是使用抗凝药物等改善脑血管循环障碍。但由于对于治疗时间的要求，绝大多数患者救治时间窗短暂。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是建立在脑缺血性损伤的基础上，由于堵塞的血管血流重新供应，氧自由基生成过多并发生累积，从而进一步加重脑组织损伤。Ca2+超载是由于组织或细胞内Ca2+增多导致细胞结构和功能产生异常的现象，是引发神经细胞凋亡最主要的因素[4]。脑CIRI 病理过程中Ca2+超载和氧自由基损伤起到重要作用，现有研究表明，大豆异黄酮（soy isoflavones，SI）可降低Ca2+浓度和氧自由基，进而减轻大鼠脑组织由于氧化应激造成的损伤[5-8]。本研究通过建立大鼠脑CIRI 模型，观测大鼠脑组织氧化应激和Ca2+超载损伤，探究大豆异黄酮对大鼠CIRI 后的保护作用及机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠，200 ～300 g，由济南鹏悦公司提供[许可证号：SCXK（鲁）2019-0003]，且动物实验经过蚌埠医学院实验动物伦理委员会审查并批准（伦审编号：2022-209），SI 由Acmec 公司提供，纯度为40%。

1.2 仪器与试剂

采用Servicebio 公司生产多功能酶标仪。2，3，5- 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染液由Solarbio 提供。南京建成生物工程研究所提供Ca2+检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组 采用随机数表法将SD 大鼠分为三组。取30 只生理状况相同的雄性SD 大鼠按照1 ～30 号进行编号，将选取的大鼠编号除以3，得到余数为0、1 和2。将余数为0 的大鼠分到假手术组（Sham 组），余数为1 的大鼠分到模型组（CIRI 组），余数为2 的大鼠分到大豆异黄酮组（SI组），每组各10 只。Sham 组：插入线栓但不造成大鼠大脑中动脉阻塞；CIRI 组和SI 组采用线拴法堵塞大脑中动脉造模；SI 组造模前21 d，给予SI 灌胃处理（120 mg/kg）。造模前21 d，Sham 组和CIRI 组同时给予等体积生理盐水。

1.3.2 动物模型制备 采用大鼠大脑中动脉栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立模型。采用10%水合氯醛麻醉大鼠，四肢与头部固定，在颈正中部位做纵向切口，剥离出大鼠左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），CCA 远离心脏一端用动脉夹夹闭，靠近心脏一端结扎CCA、ECA。然后在距离颈总动脉分叉部2 ～3 mm 处用血管剪剪出一小口，将栓线沿切口插入并固定，等待2 h 后拔出栓线形成大鼠CIRI 模型，并于造模24 h 后处死大鼠。

1.3.3 大鼠神经功能学评分 再灌注24 h 后根据大鼠神经功能学评分表（Zea-Longa 评分标准[9]）对三组大鼠进行神经功能学评分。无神经功能损伤记0 分；不能完全伸展右前爪记1 分；行走时向右侧转圈记2 分；行走时向右侧倾斜记3 分；不能自发行走且意识丧失记4 分；死亡记5 分。记录该组大鼠各项神经功能实验分值之和，分值越高，代表大鼠脑损伤越严重。

1.3.4 TTC 染色 用0.2 mmol 的PBS 溶液配制浓度为2%的TTC 染液，麻醉大鼠后快速取出全脑。将脑组织在-80℃的冰箱冰冻10 min 后每隔2 mm横向切片，共切6 片。脑切片置于2% TTC 溶液中，37℃避光水浴30 min 进行染色。

1.3.5 大脑梗死率计算 应用Image J 软件对病灶脑组织区域的光密度进行分析，记录光密度值并计算梗死率。

1.3.6 脑组织HE 染色 分别取三组脑组织于4%的甲醛溶液中固定。进行常规脱水处理、石蜡包埋和制备脑组织切片。切片经HE 染色后置于光学显微镜下观察大鼠脑组织结构的变化。

1.3.7 各项指标测定 Ca2+含量、SOD 活力、MDA水平采用化学比色法测定，具体操作方法参照试剂盒说明书。

1.4 统计学处理

应用SPSS 20.0 统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（± s）表示，组间数据比较采用单因素方差分析，两样本间数据比较采用LSD检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠神经功能学评分比较

三组大鼠造模前神经行为学评分均为0分，神经功能正常。造模后出现以下神经症状，如不能完全伸展右侧前爪、行走时向右侧转圈和向右侧倾倒。参照量表标准，再灌注24 h 后，SI 组大鼠神经行为学评分与CIRI 组大鼠相比分数明显降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。

表1 三组大鼠神经行为学评分和脑梗死率（± s）

表1 三组大鼠神经行为学评分和脑梗死率（± s）

注 与Sham组比较，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01，与CIRI组比较，bP ＜ 0.05，bbP ＜ 0.01；CIRI：缺血再灌注损伤；SI：大豆异黄酮

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2.2 三组大鼠脑TTC染色结果与脑梗死率比较

经TTC 染色后，大鼠病灶脑组织区域为白色，正常部位为红色。Sham 组大鼠脑组织染色结果显示为红色，组织完整，结构对称性好，脑梗死率与CIRI 组相比差异有统计学意义（P＜ 0.05）。CIRI组大鼠脑组织右侧病灶区域出现白色梗死灶，梗死灶大小不均。SI 组梗死灶面积有所减小，但部分组织切片仍可见小面积白色梗死灶，脑梗死率与CIRI组相比差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图1、表1。

图1 三组大鼠脑TTC 染色结果

2.3 三组大鼠脑组织病理切片观察

HE 染色下光学显微镜观察大鼠脑组织结构，Sham 组未见脑组织缺血改变，大鼠脑神经细胞排列正常，形态完整，核仁和胞质结构清晰。CIRI 组细胞间隙增大组织疏松，排列紊乱，细胞核发生明显固缩，深染。SI 组同CIRI 组相比，细胞核发生固缩的细胞明显减少，细胞间隙减小。见图2。

图2 三组大鼠HE 染色及光学显微镜下观察（HE 染色，400×）

2.4 三组大鼠脑组织SOD活力、MDA水平和Ca2+含量比较

与Sham 组相比，CIRI 组大鼠脑组织SOD 活力明显降低，MDA 水平和Ca2+含量明显升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。与CIRI 组相比，SI组大鼠脑组织SOD 活力明显升高，MDA 水平和Ca2+含量明显降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 三组脑组织SOD活力、MDA水平及Ca2+含量比较（± s）

表2 三组脑组织SOD活力、MDA水平及Ca2+含量比较（± s）

注 与Sham组比较，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01，与CIRI组比较，bP ＜ 0.05，bbP ＜ 0.01；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

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3 讨论

SI 是一种主要从大豆中提取的三苯基异黄酮类化合物，它与雌二醇类似并具有雌激素样活力，因此被称为“植物雌激素”[10]。SI 既有雌激素的药理学特性，相比于动物雌激素又少有临床上的一些毒副作用，其明显的生物学作用受到业界广泛关注，在抗氧化、抗癌、治疗心血管疾病等方面都有重要功效。近年来研究表明，SI 在减轻脑缺血和再灌注损伤中也发挥一定的作用，其作用与报道的金雀异黄酮治疗脑CIRI 一致[11]。

本研究发现，与CIRI组相比，给予SI预处理后，大鼠神经功能学评分和脑梗死率明显降低，这表明SI 能缓解大鼠脑CIRI 引起的神经功能障碍。此外，发生脑CIRI 后，脑组织损伤体现为细胞核固缩和细胞水肿等病理变化，而给予SI 预处理后，细胞密度增加，核固缩和水肿细胞数明显降低，这些形态学改变与大鼠神经功能学评分和脑梗死率趋势一致，提示SI 可减轻脑CIRI 后大鼠脑组织病变[12]。

脑CIRI 的病理机制较为复杂，目前对已知引发脑CIRI 机制的观点主要有四种[13]：①氧化应激在脑CIRI 中的作用；②兴奋性氨基酸毒性在脑CIRI中的作用；③Ca2+超载在脑CIRI 中的作用；④炎症反应在脑CIRI 中的作用。而在这四种机制中，最主流的是氧化应激和Ca2+超载作用诱发脑CIRI。

SOD 是体内重要的抗氧化酶，能特异性地清除超氧阴离子自由基，抑制脂质过氧化，对抗氧化应激对细胞的损伤[14]。血液再灌注带来的氧一方面在黄嘌呤氧化酶的催化作用下变成新的氧自由基，同时又将氧自由基转化为脂质过氧化物，使得MDA 生成增多，SOD 因消耗而减少，所以常用SOD 活力和MDA 水平来反映脑组织氧化损伤程度[15-16]。本研究发现，大鼠脑CIRI 后，大鼠脑组织内脂质过氧化物水平改变、SOD 活力降低、MDA 水平升高，提示大鼠脑组织缺血再灌注后因氧化应激造成的损伤加重。本研究表明，脑CIRI 大鼠给予SI 预处理后能显著降低MDA 水平，提高大鼠脑组织中SOD 活力。提示SI 可以通过提高SOD 活力，进而抑制脂质过氧化反应，减轻大鼠再灌注期间脑氧化应激损伤。

Ca2+超载的发生一是由于缺血缺氧引起细胞能量代谢障碍，Ca2+泵的活力受到抑制，Ca2+外流减少，细胞内Ca2+浓度增加。二是因为再灌注期间，Na+/Ca2+交换体的交换发生异常[17-18]。当大鼠脑缺血再灌注后，缺血缺氧会导致Ca2+内流，内流的Ca2+使得线粒体膜渗透性转化增强，引起氧自由基增加，导致细胞氧化应激损伤[19]。因此可以通过检测大鼠脑组织Ca2+浓度来评估脑组织损伤程度[20-21]。本研究发现，与CIRI 组相比，大豆异黄酮预处理能够显著降低CIRI 大鼠脑组织内Ca2+浓度，这提示大豆异黄酮可能通过降低Ca2+超载从而对大鼠脑CIRI 起保护作用。

综上所述，本研究发现，SI 可能通过降低CIRI后大鼠脑组织Ca2+超载、减轻大鼠因为脑氧化应激反应造成的损伤，从而发挥大鼠脑神经保护的作用。同时也提示，SI 对大鼠脑CIRI 的保护机制可能在于减轻氧自由基累积和Ca2+超载所造成的联合损伤。而对SI 怎样作用于Ca2+超载后引发氧自由基增多的途径本研究未有探究，具体相关机制有待进一步探讨。