大蒜素对MPP+所致的PC12细胞损伤的保护作用研究

杨传彬,韩晓彬,秦小娇,杨嘉君

(上海交通大学医学院附属第六人民医院 神经内科,上海200233)

帕金森病在神经退行性疾病中是比较常见的,其发病机制和多巴胺能神经元的选择性死亡、黑质缺失以及细胞内Lewy小体的形成有关[1-2]。到目前为止,帕金森病的病因尚不十分清楚。但有证据表明,衰老、自身免疫、毒性物质以及氧化应激等与其发病机理息息相关[3-4]。在这些影响因素中,导致多巴胺能神经元变性的关键因素是氧化应激,这是由于在细胞中氧自由基的产生和清除失衡,使活性氮(RNS)和活性氧(ROS)等物质造成的氧化损伤[5]。ROS可引起脂质过氧化、基因突变和蛋白质变性,亦可导致神经细胞损伤和细胞凋亡[6]。1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)可以使ROS的产生增加,引起线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡[7-9]。因此,应用MPP+所致的PC12细胞功能障碍和凋亡可以作为研究氧化应激引起的帕金森病的有效模型。

大蒜素是大蒜的主要生物活性成分,具有免疫调节、抗癌、抗衰老、抗菌、抗高血压和抗动脉粥样硬化作用[10-13]。大蒜素可以通过促进抗氧化物的产生,降低细胞毒副产物以及游离氧自由基的吸收[14]。同时也具有神经保护作用,通过启动氧化应激和凋亡程序来保护细胞免受缺血性神经损伤[15-16]。也有研究报道[17],大蒜素可以通过影响内源性抗氧化系统和线粒体功能来保护6-羟基多巴胺诱导的PD相关的神经元损伤。但大蒜素对氧化应激损伤引起的细胞凋亡的保护作用机制,目前尚不完全清楚。

因此,本研究采用MPP+诱导PC12细胞建立体外神经元氧化应激损伤和凋亡模型,同时观察大蒜素对神经元氧化应激损伤的保护作用及调控细胞凋亡相关蛋白表达水平的变化,探讨大蒜素对神经元氧化应激损伤保护作用的细胞凋亡调控机制,以期为神经保护的可能信号通路以及帕金森病的预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞购于ATCC细胞库;大蒜素购自国家药品生物制品检验所(北京);DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素和胰蛋白酶均购于Gibco公司;MTT试剂盒购于索莱宝公司;SOD、MDA试剂盒购于南京建成生物科技有限公司;ROS检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒购于翊圣公司;BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天公司;Bcl-2抗体、Bax抗体、Cleaved-caspase 3抗体、Cyt C抗体以及β-Actin抗体均购于Abcam公司。

1.2 PC12细胞的培养与分组

1.2.1PC12细胞的培养

PC12细胞为贴壁细胞,用含10%的胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养液,在5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养,隔天换液,1～2 d传代,取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2PC12细胞的实验分组

实验分组:对照组、模型组(4 mM的MPP+处理组)、实验组即4 mM的MPP+与不同浓度的大蒜素(0.01、0.1和1 μg/mL)的联合培养组。

1.3 MTT法检测大蒜素对MPP+诱导的PC12细胞增殖活力的影响

将对数生长期细胞以5×104/ml接种于96孔板,每孔加入100 μl 细胞悬液,每组6个平行孔,37℃、5% CO2培养过夜,待细胞贴壁后,每孔加入4 mM的MPP+新鲜培养液,实验组加入大蒜素,使其终浓度分别为0.01、0.1和1 μg/mL,继续培养24 h,空白组和对照组除不给予MPP+处理及不加入药物外,其他处理同上。吸去旧培养液,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液,孵育4 h后采用酶标仪在490 nm波长下测定各孔的OD值。实验重复3次,细胞相对存活率(%)=(实验组平均吸光度值-空白组平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值-空白组平均吸光度值)×100%。

1.4 细胞氧化应激水平检测

1.4.1ROS含量检测

PC12细胞以密度5×105/mL,每孔250 μL接种于24孔板中,细胞贴壁后按照实验分组处理后于37℃、5% CO2培养箱内孵育24 h,之后使用流式细胞术检测各组细胞中ROS的含量。

1.4.2生化指标SOD、MDA活性的检测

PC12细胞以密度5×105/mL,每孔250 μL接种于24孔板中,细胞贴壁后按照实验分组处理后于培养箱内孵育24 h,根据试剂盒的要求提取细胞总蛋白质,并测定细胞中SOD和MDA的含量。

1.5 细胞凋亡检测

取对数生长期的PC12细胞制成 5×105/mL的细胞悬液接种于6孔板内,待细胞贴壁后,按上述实验分组加处理因素,5% CO2、37℃培养24 h后弃去培养液,收集各组细胞,用预冷的PBS洗涤2次,加入100 μL 1× Binding Buffer吹打混匀,之后每个样品加入5 μL AnnexinV-FITC(20 μg/mL)和5 μL PI(50 μg/mL),同时以不加AnnexinV-FITC 和PI的空白管作为阴性对照,室温下避光20 min,之后加入400 μL Binding buffer,混匀后立即用流式细胞术进行定量检测。

1.6 Western blot检测

将对数生长期的PC12细胞按照5×105/mL的密度接种于6孔板内,待细胞贴壁后,按照实验分组要求给予不同处理,24 h后提取细胞总蛋白。各取10 μl样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),之后转移到0.25 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5% BSA室温摇床封闭2 h。随后分别加入Cyt C抗体和凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3抗体,以β-Actin抗体作为内参蛋白,4℃过夜。用Tris-盐酸缓冲液(TBST)(含0.05% Tween-20)洗膜3次,10 min/次。再加入相应的辣根过氧化物(HRP)标记的二抗,于摇床室温孵育1 h,TBST洗10 min×3次。化学发光液(ECL)1∶1配制后用化学发光仪检测,采用Image J软件分析各目的条带的吸光度值(AA),把各组蛋白与其对应的内参蛋白β-Actin的AA比值作为该蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析

所有的实验结果均取自3次以上的独立实验,数据以均值±标准差表示,然后采用单因素方差分析将这些数据导入GraphPad 7.0软件进行统计分析。其中P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测大蒜素对MPP+诱导PC12细胞损伤的保护作用

与对照组相比,MPP+诱导组的PC12细胞的存活百分率显著下降(P<0.05),且呈浓度依赖性(图1A);而通过不同剂量大蒜素(0.01、0.1、1和10 μg/mL)处理后,细胞相对存活率增加,但剂量为10 μg/mL时,细胞相对存活率明显下降(P<0.05)(图1B),因此实验组的大蒜素浓度选取为0.01、0.1和1 μg/mL。与模型组相比,4 mM的MPP+与不同浓度的大蒜素(0.01、0.1和1 μg/mL)联合培养组的细胞相对存活率明显增加(P<0.05),而且呈浓度依赖性(图1C)。

图1 不同浓度大蒜素及MPP+对PC12细胞活力的影响

2.2 大蒜素对MPP+诱导的PC12细胞内ROS的影响

和对照组比较,MPP+诱导组中ROS的相对荧光强度(RFU)显著升高(P<0.05);与MPP+诱导组比较,经不同剂量大蒜素干预后,PC12细胞内ROS水平均随着药物浓度升高而降低(P<0.05)。结果见图2。

图2 大蒜素对MPP+诱导的PC12细胞ROS产生的影响

2.3 大蒜素对MPP+诱导的PC12细胞内SOD、MDA水平的影响

和对照组比较,MPP+诱导组中SOD水平显著降低(P<0.05);与MPP+诱导组比较,经不同剂量大蒜素干预后,PC12细胞内SOD水平均随着药物浓度升高而升高(P<0.05),且呈浓度依赖性(图3A)。和对照组比较,MPP+诱导组中MDA水平显著升高(P<0.05);与MPP+诱导组比较,经不同剂量大蒜素干预后,PC12细胞内MDA水平均随着药物浓度升高而降低(P<0.05),且呈浓度依赖性(图3B)。

图3 大蒜素对MPP+诱导的PC12细胞SOD和MDA水平的影响

2.4 Annexin V-FITC细胞凋亡检测

和对照组比较,MPP+诱导组中细胞凋亡水平显著升高(P<0.05);与MPP+诱导组比较,经不同剂量大蒜素干预后,PC12细胞的凋亡水平均随着药物浓度升高而降低(P<0.05),且呈浓度依赖性(图4)。

图4 大蒜素对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的影响

2.5 Western blot检测大蒜素对MPP+诱导PC12细胞中Cyt C信号通路相关蛋白及凋亡相关因子Bcl-2、Cleaved-caspase 3、Bax表达的影响

与正常组比较,模型组Bcl-2、Cyt C表达明显降低(P<0.05)(图5B、5E), Bax、Cleaved-caspase 3表达明显增高(P<0.05)(图5C、5D);与模型组比较,不同剂量大蒜素干预组Bcl-2、Cyt C表达显著增加(P<0.05)(图5B、5E), Bax、Cleaved-caspase 3表达明显降低(P<0.05)(图5C、5D)。

图5 大蒜素对MPP+诱导的PC12细胞相关蛋白表达的影响

3 讨论

帕金森病是一类神经退行性疾病,目前的研究认为其和氧化/抗氧化失衡引起的细胞损伤有关。本研究通过MPP+处理PC12细胞建立帕金森病的细胞模型,并使用大蒜素进行干预,通过对细胞氧化应激和凋亡水平的影响,探讨对帕金森病的保护作用。

大蒜素,是一种从大蒜中提取的活性化合物,具有抗肿瘤、抗炎症和抗氧化等作用[18-19],同时也具有神经保护作用。体内及体外的研究均证实大蒜素通过Akt/eNOS信号通路发挥其抗氧化及抗炎作用,对创伤性脑损伤大鼠有神经保护作用[16,20]。另外,大蒜素可以通过增强Nrf2抗氧化信号通路来保护神经细胞以改善认知和记忆缺陷[21],大蒜素也可改善阿尔茨海默病模型的空间记忆障碍,减少神经元死亡[22]。又有研究报道大蒜素也可以通过影响线粒体功能来保护H2O2诱导的神经元损伤[23]。本研究首次通过大蒜素对MPP+诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的影响,研究其对帕金森病的保护作用。本研究通过检测不同浓度的大蒜素处理后的PC12细胞的增殖活性,发现0.01、0.1和1 μg/mL浓度的大蒜素对PC12细胞无毒性作用,而10 μg/mL 的大蒜素可显著降低细胞的活性。有研究报道[24]1 mM浓度的大蒜素可以显著降低PC12细胞的存活能力。本研究结果与之一致,即大剂量的大蒜素可以对PC12细胞产生毒性作用。因此最终选取3种浓度相对较低的大蒜素(0.01、0.1和1 μg/mL)进行后续实验。为建立神经毒性模型,本研究通过给予PC12细胞不同浓度的MPP+处理,结果发现4 mM的MPP+处理PC12细胞后表现为较为适中的细胞增殖活性,因此在后续实验中选取4 mM的MPP+对PC12细胞进行诱导干预。结果发现大蒜素通过剂量依赖的方式减弱了MPP+对PC12细胞增殖活性的抑制作用,即大蒜素通过提高细胞增殖活力对MPP+诱导的PC12细胞起保护作用。

活性氧(ROS)在细胞内信号转导通路中起第二信使的作用,在炎症和氧化损伤中起中介作用。线粒体是产生ROS的主要细胞器,也是ROS的主要靶点。ROS与氧化应激相关,参与细胞凋亡、坏死和自噬等多种生物过程。氧化应激可能通过活性氧的产生造成神经损伤,引起神经退行性疾病。有研究证明,ROS的产生可以导致PC12细胞的凋亡[25-26],而大蒜素可以通过诱导产生抗氧化产物,减少细胞毒性物质和清除各种自由基[27],保护细胞免受氧化应激损伤。本研究通过对ROS的检测,发现大蒜素降低了MPP+诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞ROS的产生,与以往的研究相一致,从而说明了大蒜素可以减少细胞内ROS的产生而对细胞起保护作用。

细胞膜中的不饱和磷脂易受自由基攻击,引发连锁反应,导致如丙二醛(MDA)等产物的积累,又通过产生氧化应激对细胞造成损害。细胞通常会对氧化应激作出反应,通过酶促反应[28]降低氧化应激,以提高细胞的防御能力,防止细胞损伤。抗氧化应激系统包括抗氧化酶SOD,CAT和GSH-Px等,是对抗过量氧自由基的第一道防线。有研究证实,大蒜素可通过增强抗氧化酶活性和改善线粒体功能,对兔脊髓缺血/再灌注损伤具有保护作用[29]。也有研究报道大蒜素可通过影响内源性抗氧化系统和线粒体功能来保护6-羟基多巴胺诱导的PD相关的神经元损伤[17]。说明氧化应激可造成PD的神经损伤,而本研究与之一致,本研究通过对SOD、MDA的检测发现,大蒜素减少了MPP+所致的PC12细胞MDA的产生,并提高了抗氧化酶SOD的表达,表明大蒜素可以通过增加内源性抗氧化酶的活性来提高细胞的抗氧化能力,减少氧化产物的生成,从而对MPP+造成的PC12细胞的氧化损伤起保护作用。

凋亡是细胞周期中不可或缺的一部分,是一个程序性细胞死亡的过程,是机体正常发育和组织内环境稳定的一个重要环节。细胞的凋亡受细胞凋亡相关蛋白的调控,促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2同属于Bcl-2家族,Bcl-2与Bax可以改变细胞内线粒体内膜的通透性,进而调节凋亡激活物细胞色素C(Cyt C)等的释放,活化下游Caspase,进一步诱导细胞凋亡[30-31]。研究发现大蒜素有抑制细胞凋亡的作用[32-33]。因此为了研究大蒜素对MPP+诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞引起的凋亡情况,本研究使用流式细胞仪,采用AnnexinV-FITC/PI双染法对PC12细胞的凋亡情况进行检测,结果发现,大蒜素可以明显抑制MPP+对PC12细胞造成的凋亡。同时使用Western blot对相应的凋亡蛋白进行了检测,结果发现大蒜素逆转了MPP+对PC12细胞线粒体Cyt C以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3的表达的影响。这些结果说明大蒜素可能是通过线粒体途径增强了细胞的抗凋亡活性,从而抑制了MPP+所致的PC12细胞的凋亡。

综上所述,具有抗炎、抗菌、抗高血压和抗癌活性等功能的大蒜素[34-35],可以显著降低MPP+引起的PC12细胞的损伤,这种对细胞的保护作用可能是通过线粒体途径提高了细胞的抗凋亡及抗氧化酶活性,从而抑制细胞的凋亡来完成的。因此作为一种中草药提取物,大蒜素对PD具有潜在的神经保护作用,有望为临床PD的预防和治疗提供理论依据。