AOX1调控平滑肌细胞表型转换参与动脉钙化的研究

张倩茹,查 晴,陈 辉,张 煜,杨 克,刘 艳*

(1.上海交通大学医学院附属第九人民医院 心血管内科,上海200011;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院 心血管内科,上海200025)

动脉钙化主要发生在内膜,是未来冠心病的独立预测因子[1],目前冠心病的发病率和死亡率逐年升高[2-3],已成为全球较为严重的公共卫生问题。动脉钙化病变过程中,血脂异常可引起血管壁中脂质沉积,并形成氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL),继而影响血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC),引起细胞氧化应激反应,细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增多[4],ROS与谷胱甘肽(glutathione,GSH)结合,在谷胱甘肽还原酶催化作用下转化为氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG),即ROS与GSH间存在动态平衡关系,而ROS与GSH间不平衡导致氧化应激可触发多种病理生理变化[5-6],导致一系列细胞功能异常,诱发斑块形成。VSMC作为动脉中比例最高的细胞类型,参与动脉钙化的整个病变过程[7],平滑肌细胞从收缩表型(contractile phenotype)向合成型表型(synthetic phenotype)转换[8],是动脉钙化进展的重要细胞学改变和事件。醛氧化酶1(aldehyde oxidase,AOX1)属于钼黄素(molybdoflavo enzyme,MOFEs)家族,AOX1可作为一种解毒酶参与体内代谢过程,主要参与着氧化还原反应,而这一过程中,AOX1促进细胞内过氧化氢的产生,ROS生成增多[9],从而参与细胞凋亡、增殖及分化功能[10-11],但AOX1与动脉钙化之间无相关报道。

1 材料与方法

1.1 材料

4周龄、雄性C57BL/6J小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司)用于VSMC的提取。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)、青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)双抗溶液、抗青霉素-链霉素-新霉素(anti-penicillin,streptomycin,and neomycin)三抗溶液、0.25%胰蛋白酶(trypsin)、DMEM培养基(dulbecco’s modified eagle medium)均购自美国Gibco公司。活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit,也称ROS Assay Kit)、GSH和GSSG检测试剂盒(GSH and GSSG Assay Kit)和RIPA裂解液购自碧云天公司(中国)。oxLDL购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 方法

1.2.1VSMC的提取 将小鼠麻醉致死,剥离取小鼠主动脉并浸泡于10%的三抗溶液中;显微镜下仔细剥离血管周围组织;超净台中三抗溶液清洗血管组织3次;剪成小组织块。加入少许FBS放入培养箱1 h;待FBS将组织块黏于皿底后加入DMEM培养基(DMEM+20%FBS+1%双抗);培养至约1周,可见组织块边缘有平滑肌细胞爬出;用胰酶将细胞消化下来,重新接种于新的培养皿,用于后续细胞实验。

1.2.2活性氧检测试验 oxLDL 0、12.5、25 和50 μg/mL分别刺激VSMC 24 h。按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液,每个六孔板的1个孔加入1 ml稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。荧光显微镜下拍照观察。实验重复5次。

1.2.3GSH和GSSG检测试验 oxLDL 0、12.5、25和50 μg/mL分别刺激VSMC 24 h。配置GSSG储备液、DTNB储备液、蛋白去除试剂M溶液、NADPH储备液、稀释谷胱甘肽还原酶、工作液,PBS洗涤细胞1次,RIPA裂解液离心收集细胞;加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂M溶液,充分Vortex;液氮和37℃水浴对样品进行两次快速的冻融;4℃,10 000 g离心10 min取上清。加入稀释的GSH清除辅助液vortex混匀;加入GSH清除工作液vortex混匀,25℃反应60 min;加入工作液进行检测,酶标仪测定A412。实验重复5次。

1.2.4蛋白质印迹(Western blotting) 运用细胞裂解液提取总蛋白;样品100℃加热10 min制样;将样品和标志物加入电泳胶的加样孔内;120 V电泳分离不同分子量的蛋白;裁胶。将聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜泡于甲醇中激活,制作转膜“三明治”顺序为:转移盒负极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-转移盒正极的顺序由下而上放置(300 mA);5%牛奶封闭1 h;洗膜缓冲液(Tris buffered saline Tween,TBST)洗3次,每次10 min;一抗4℃摇床孵育12 h;TBST 洗3次,每次10 min;二抗室温孵育1 h;配置显影液,拍照观察。利用Image J软件对条带灰度值进行分析,以B肌动蛋白作为内参蛋白。目的蛋白与内参蛋白的比值为目的蛋白的相对表达量。实验重复3 次。

1.2.5免疫组织化学(免疫组化) 取新鲜的血管样品经4%甲醛固定;石蜡包埋并切片;脱蜡。样品用枸橼酸盐修复液修复抗原表位;3%双氧水阻断内源性过氧化物酶作用20 min,TBS清洗。5%马血清室温封闭;一抗4℃孵育12 h;TBS清洗;二抗室温孵育30 min;TBS清洗。配置二氨基联苯胺显色溶液,显微镜下观察到黄色阳性染色出现后,吸掉染色液终止反应。苏木素复染细胞核3 min,洗掉染色液,盐酸乙醇分化冲洗;样品依次浸入95%乙醇3 min,无水乙醇5 min;中性树脂封片;显微镜观察。免疫组化采用半定量分析方法,采用image proplus软件分析积分光密度(integrated optical density,IOD值),最后用IOD值/面积。实验重复5次。

1.2.6统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示。两组间比较采用非配对t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 oxLDL促平滑肌细胞表型转化及氧化应激反应,降低GSH/GSSG比例

为明确oxLDL对平滑肌细胞的作用,以不同浓度oxLDL(0、12.5、25.0和50.0ug/ml)刺激平滑肌细胞24 h,结果显示随着oxLDL刺激浓度升高,细胞内ROS生成水平呈明显的剂量依赖性升高;平滑肌细胞内GSH/GSSG比例随oxLDL刺激浓度升高而显著性下降,并呈剂量相关性(见表1)。同时平滑肌细胞收缩表型分子α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、肌球蛋白重链11(myosin heavy chain 11,MYH11)表达下降,合成表型分子骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Gla蛋白(Matrix Gla Protein,MGP)表达升高,即平滑肌细胞向合成表型转换(见图1)。

图1 oxLDL对平滑肌细胞ROS生成及GSH/GSSG的影响

表1 oxLDL对VSMC的表型分子蛋白表达量

2.2 AOX1参与oxLDL诱导的平滑肌细胞表型转化

为进一步了解AOX1对平滑肌细胞调控作用,用AOX1敲减病毒感染平滑肌细胞,同时oxLDL(50 μg/mL)刺激细胞24 h。结果显示,AOX1敲减后,平滑肌细胞收缩表型分子表达升高,而合成表型分子表达下降(见表2)。即AOX1降低抑制平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化。

表2 AOX1对VSMC的表型分子蛋白表达量的影响

平滑肌细胞感染AOX1及对照组敲减病毒后,使用oxLDL(50 μg/mL)刺激24 h后检测平滑肌细胞表型分子(以β-actin为内参照基因)。

2.3 AOX1调控ROS生成及GSH/GSSG

为探究AOX1参与oxLDL诱导的平滑肌细胞表型转化的具体机制,在平滑肌细胞中导入特异性siRNA敲减AOX1表达,在oxLDL刺激下观察AOX1表达变化,并同时观察ROS及GSH/GSSG水平变化。结果发现:敲减AOX1后,可显著性抑制oxLDL诱导的ROS升高及GSH/GSSG下降(图2)。证实oxLDL刺激下调控AOX1升高,诱发平滑肌细胞内ROS-GSH失衡,导致平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化。

图2 AOX1对VSMCROS生成及GSH/GSSG的影响

2.4 人动脉钙化斑块组织中AOX1表达升高,且定位于平滑肌细胞

为更进一步探究AOX1在动脉钙化斑块组织中表达及定位情况,本课题组通过伦理委员会论证审核后,收集人动脉钙化斑块及正常血管组织,使用荧光免疫组化检测AOX1在斑块及正常血管组织中表达及定位。结果显示相较于正常血管组织,AOX1在动脉钙化斑块组织中表达升高,并定位于平滑肌细胞(αSMA阳性,见图3)。

图3 AOX1在斑块组织中表达情况

3 讨论

本研究发现,oxLDL刺激促进平滑肌细胞表型转化及氧化应激反应,降低GSH/GSSG比例及AOX1表达升高,而AOX1病毒敲减之后可显著抑制平滑肌细胞表型转化,ROS生成且AOX1在动脉粥样硬化斑块组织中表达升高,并定位于血管平滑肌细胞。提示AOX1参与脂质诱导的平滑肌细胞表型转换,从而参与动脉钙化。

动脉钙化由许多局部和全身因素参与,包括高脂血症、炎症、氧化应激、高血压和糖尿病[12]。健康的血管处于促氧化和抗氧化的平衡之中,当这种平衡被扰乱时,如活性氧生成增多就会发生内皮功能障碍,导致血管发生钙化[13-14]。钙化血管细胞来源于局部的平滑肌细胞和循环中的造血干细胞血管,其中平滑肌细胞是动脉管壁的重要组成部分[15]。以往研究发现,血管平滑肌细胞表型转换是动脉壁的适应性反应,导致内膜增厚,进一步发展为钙化[16-17]。还有研究表明,血管平滑肌细胞成骨分化是启动动脉钙化的机制之一[18-20]。以往的研究显示,GSH在与ROS结合后,在谷胱甘肽还原酶催化作用下转化为GSSG,达到清除ROS的生物学效应,但GSSG也可转化为GSH[21]。故此,ROS与GSH间存在动态平衡关系,而ROS与GSH间不平衡导致氧化应激可触发多种病理生理变化[5-6]。本研究发现oxLDL可诱导平滑肌细胞ROS升高,进而导致平滑肌细胞表型转化[22]。因此推测在oxLDL刺激导致的平滑肌细胞表型转化过程中,ROS-GSH与平滑肌表型转化存在相关性。

AOX1主要存在于哺乳动物细胞质中,广泛分布于体内多个组织器官中,肝脏表达量最高,并受肝内活性的影响[23],此外,内分泌组织和脑中也可检测到AOX1活性[24]。AOX1可作为一种解毒酶参与体内代谢过程,AOX1的活性导致过氧化氢的产生,这也促进了ROS的产生,同时也可能诱导AMPK的磷酸化。AOX1催化活性需要黄素腺嘌呤二核苷酸和钼蝶呤辅因子,AOX1催化杂环的羟基化和多种醛化合物氧化成相应的羧酸[25],参与氧化还原反应,氧化的最终产物是像P450一样的羟基化底物[26]。而这一过程中,AOX1促进细胞内ROS生成增多[9],从而参与细胞凋亡、增殖及分化功能[10-11]。然而,AOX1与动脉钙化之间无相关报道,本研究首次证实,AOX1参与oxLDL诱导的平滑肌细胞表型转换进而参与动脉钙化。

动脉钙化病理过程复杂,受多方面因素调控,本研究仅通过细胞水平体外研究其发病机制具有一定局限性。此外,脂质如何通过AOX1诱导表型转换的具体机制还有待进一步探究。动脉钙化是心血管事件和全因死亡的风险标志物,进一步阐明动脉钙化分子机制有望为动脉钙化提供新的治疗靶点。