miR-138-5p调控CDC5L表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响

王欧洋 朱鹏磊 林杰 童凌云

[摘要] 目的 探讨微RNA（microRNA，miR）-138-5p对胶质瘤细胞增殖、侵袭的调控机制。方法 体外培养人胶质瘤U251细胞，采用随机数字表法将其分为对照组（n=6）、miR-NC组（n=6）、miR-138-5p组（n=6）、miR-138-5p+pc-NC组（n=6）、miR-138-5p+pc-细胞分裂周期5样（cell division cycle 5-like，CDC5L）组（n=6）。采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测细胞中miR-138-5p、CDC5L mRNA水平，检测细胞增殖活力、细胞周期和细胞凋亡以及细胞侵袭能力，检测细胞中CDC5L和侵袭相关蛋白表达。结果 miR-138-5p的过表达可下调CDC5L mRNA和蛋白水平，降低胶质瘤细胞增殖活力和侵袭能力，并诱导G2/M期细胞周期停滞，促进细胞凋亡，降低N-钙粘蛋白、波形蛋白水平，升高E-钙粘蛋白水平，差异均有统计学意义（P<0.05）；上调CDC5L表达可明显逆转过表达miR-138-5p对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响（P<0.05）；与miR-NC和CDC5L-WT质粒共转染比较，miR-138-5p mimic和CDC5L-WT质粒共转染的细胞中荧光素酶活性降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 过表达miR-138-5p可能通过靶向下调CDC5L，抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。

[关键词] 胶质瘤；微RNA-138-5p；細胞分裂周期5样；增殖；侵袭

[中图分类号] R739.4      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.08.010

Influences of miR-138-5p on proliferation and invasion of glioma cells by regulating CDC5L expression

WANG Ouyang， ZHU Penglei， LIN Jie， TONG Lingyun

Department of Neurosurgery， Wenzhou People's Hospital， Wenzhou 325006， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the regulatory mechanism of microRNA-138-5p （miR-138-5p） on the proliferation and invasion of glioma cells. Methods Human glioma U251 cells were cultured in vitro and divided into control group （n=6）， miR-NC group （n=6）， miR-138-5p group （n=6）， miR-138-5p+pc-NC group（n=6）， and miR-138-5p+pc-cell division cycle 5-like （CDC5L） group （n=6） according to the random number table method. Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） was performed to measure the levels of miR-138-5p and CDC5L mRNA in cells， to measure cell proliferation viability， cell cycle and apoptosis， and cell invasion ability， and to measure the expression of CDC5L and invasion-related proteins in cells. Results Overexpression of miR-138-5p was able to down-regulate CDC5L mRNA and protein levels， reduce the proliferative viability and invasive ability of glioma cells， induce cell cycle arrest in G2/M phase， promote cell apoptosis， and reduce N-cadherin and Vimentin levels， increased E-cadherin level， and the differences were statistically significant （P<0.05）; up-regulation of CDC5L expression was able to significantly reverse the effects of overexpression of miR-138-5p on the malignant biological behavior of of glioma cell （P<0.05）; the dual luciferase assay showed that compared with co-transfection of miR-NC and CDC5L-WT plasmids， the luciferase activity in cells co-transfected with miR-138-5p mimic and CDC5L-WT plasmids was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Overexpression of miR-138-5p may inhibit the proliferation and invasion of glioma cells by targeting down-regulation of CDC5L.

[Key words] Glioma; MicroRNA-138-5p; Cell division cycle 5-like; Proliferation; Invasion

胶质瘤是一种侵袭性极强的中枢神经系统恶性肿瘤，具有生长快、死亡率高、平均生存时间短的特点[1]，已成为对人类生命和健康造成极大危害的疾病之一。目前，传统的手术切除、放疗、化疗结合的多模式治疗并未明显改善胶质瘤患者的预后[2]。微RNA（microRNA，miR）与特定靶mRNA结合以调节转录后基因表达，被认为是目前有希望用于神经胶质瘤诊断和预后的生物标志物和分子治疗靶点[3-4]。miR-138-5p是一种肿瘤抑制miRNA，在黑色素瘤[5]、视网膜母细胞瘤[6]、胶质瘤[7-8]等恶性肿瘤中均下调。miR-138-5p的过表达对胶质瘤细胞的恶性生物学行为具有抑制作用[7]，但其潜在的分子机制仍未完全明确，需要进一步研究。细胞分裂周期5样（cell division cycle 5-like，CDC5L）蛋白是细胞周期G2/M转换的调节剂，在多种癌症中充当癌基因作用，被认为是肿瘤治疗的潜在靶点[9-10]。据报道，CDC5L在胶质瘤组织中高度表达，其表达与胶质瘤病理分级和Ki-67表达显著相关，并且CDC5L是胶质瘤患者生存的独立预后因素[11]。生物信息学网址预测发现，CDC5L是miR-138-5p的靶基因。因此，本研究对miR-138-5p通过调控CDC5L表达对胶质瘤进展的影响进行了探讨。

1  材料与方法

1.1  细胞

从武汉普诺赛生命科技有限公司购入人胶质瘤细胞U251，货号CL-0237。U251细胞在DMEM培养基（10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中培养。

1.2  主要试剂与仪器

Lipofectamine 2000转染试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司，11668027）；miR-138-5p模拟物（miR-138-5p mimic）及其阴性对照（miR-NC）、CDC5L过表达质粒（pcDNA3.1-CDC5L）和pcDNA阴性对照（pcDNA3.1-NC）购自RiboBio（中国）；CCK-8试剂盒（C00038）、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（C1052）购自碧云天生物科技有限公司；兔源一抗CDC5L、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）购自英国Abcam公司，货号分别为ab129114、ab40772、ab76011、ab92547、ab181602。荧光定量PCR仪（ABI Prism? 7500型，美国Applied Biosystems公司）；多功能酶标仪（iMark680，美国Bio-Rad公司）；流式细胞仪（FACScan，美国BD Biosciences公司）。

1.3  方法

1.3.1  细胞分組与转染  将U251细胞以每孔5×104个细胞的密度接种于6孔板中，培养24h后进行转染。使用Lipofectamine 2000将miR-138-5p mimic、pcDNA3.1-CDC5L及其阴性对照瞬时转染到U251细胞中。实验采用随机数字表法，将细胞分为对照组（不转染，n=6）、miR-NC组（n=6）、miR-138-5p组（n=6）、miR-138-5p+pc-NC组（共转染miR-138-5p mimics和pcDNA3.1-CDC5L阴性对照pcDNA3.1- NC，n=6）、miR-138-5p+pc-CDC5L组（共转染miR- 138-5p mimic和pcDNA3.1-CDC5L，n=6）。6h后更换培养液，然后在37℃、5%CO2下常规培养48h。

1.3.2  RT-qPCR检测miR-138-5p、CDC5L表达  提取U251细胞中的总RNA，然后将总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ试剂盒在荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件：95℃ 10min，然后95℃ 10s、60℃ 20s、72℃ 30s的40个循环。GAPDH或U6分别用作mRNA或miRNA的内源性对照。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达，引物序列见表1。

1.3.3  细胞增殖活力检测  将各组细胞接种到96孔板中（每孔2000个细胞），分别在培养24h、48h和72h后，加入CCK-8试剂（10μl/孔），然后在37℃下继续培养4h。使用酶标仪测定450nm处的各孔吸光度。

1.3.4  细胞周期检测  转染48h后，收集U251细胞用于细胞周期分析。将细胞在预冷的75%乙醇中固定过夜，然后除去乙醇，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）将细胞洗涤2次，在37℃的黑暗环境中用碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液染色30min后，使用流式细胞仪分析细胞周期。

1.3.5  细胞凋亡率检测  收集细胞，用冷PBS洗涤两次，然后将细胞重新悬浮在含有5μl膜联蛋白（Annexin）V-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和10μl PI的300μl结合缓冲液中。在室温下避光孵育15min后，在流式细胞仪上检测，通过流式细胞术定量细胞凋亡率。

1.3.6  细胞侵袭能力检测  将细胞以5×104个细胞/ml的密度重悬于200μl无血清培养基中，并接种于上室（预涂有Matrigel基质胶）；下室加入500 μl DMEM培养基（含10%胎牛血清）。培养48h后，取出上室，棉签擦去上表面残留的细胞，将下表面侵入的细胞固定15min（4%多聚甲醛），然后以结晶紫染色15min。于光学显微镜下观察并计数侵入细胞数。

1.3.7  CDC5L和侵袭相关蛋白表达检测  用RIPA裂解液裂解各组U251细胞30min，离心20min，取上清液。二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测上清液中总蛋白浓度。将等量蛋白质样品（20 μg）在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上进行电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。将膜用5%脱脂牛奶在室温下封闭1h。与一抗CDC5L（1：1000）、E-钙粘蛋白（1：1000）、N-钙粘蛋白（1：1000）、波形蛋白（1：1000）和GAPDH（1：3000）在4℃下孵育过夜；而后在室温下，将膜与辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG二抗（1：5000）孵育1h。最后，通过增强化学发光法检测蛋白质，使用ImageJ软件观察并量化蛋白质条带。

1.3.8  生物信息学分析和双荧光素酶报告基因检测  使用TargetScan 7.2预测miR-138-5p和CDC5L之间的靶向结合序列。然后将含有推定的miR-138- 5p结合位点的CDC5L序列及其突变体克隆到pmirGLO双荧光素酶载体以构建报告载体CDC5L-野生型（CDC5L-WT）和CDC5L-突变型（CDC5L- MUT）。使用Lipofectamine 2000试剂将miR-138-5p mimic或miR-NC和CDC5L-WT或CDC5L-MUT共转染到U251细胞。转染48h后，获得细胞裂解物，使用双荧光素酶报告基因检测系统评估细胞裂解物中萤火虫荧光素酶活性，并将其标准化为海肾荧光素酶活性。

1.4  统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行处理分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，两组间比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  miR-138-5p、CDC5L mRNA水平比较

miR-138-5p组细胞的miR-138-5p水平显著高于对照组和miR-NC组（P<0.05），而CDC5L mRNA水平显著低于对照组和miR-NC组（P<0.05）。miR- 138-5p+pc-CDC5L组CDC5L mRNA水平显著高于miR-138-5p组和miR-138-5p+pc-NC组（P<0.05），见表2。

2.2  细胞增殖活力比较

在48h和72h时，miR-138-5p组的细胞增殖活力均显著低于对照组和miR-NC组（P<0.05）；miR-138-5p+pc-CDC5L组细胞增殖活力显著高于miR-138-5p组和miR-138-5p+pc-NC组（P<0.05），见表3。

2.3  细胞周期分布比较

与对照组和miR-NC组相比，miR-138-5p组G0/G1期细胞比例显著降低（P<0.05），S期（q=8.636、9.264）和G2/M期细胞比例显著升高（P<0.05）；与miR-138-5p组、miR-138-5p+pc-NC组相比，miR- 138-5p+pc-CDC5L组G0/G1期细胞比例显著升高（P<0.05），S期和G2/M期细胞比例显著降低（P<0.05），見图1、表4。

2.4  细胞凋亡率比较

与对照组、miR-NC组相比，miR-138-5p组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与miR-138-5p组、miR- 138-5p+pc-NC组相比，miR-138-5p+pc-CDC5L组细胞凋亡率显著降低（P<0.05），见图2、表5。

2.5  细胞侵袭能力比较

与对照组、miR-NC组相比，miR-138-5p组侵袭细胞数显著降低（P<0.05）；与miR-138-5p组、miR-138-5p+pc-NC组相比，miR-138-5p+pc-CDC5L组侵袭细胞数显著增多（P<0.05），见图3、表5。

2.6  CDC5L、E-鈣粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白水平比较

与对照组、miR-NC组相比，miR-138-5p组CDC5L、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达均显著降低（P<0.05），E-钙粘蛋白表达显著升高（P<0.05）；与miR-138-5p组、miR-138-5p+pc-NC组相比，miR- 138-5p+pc-CDC5L组CDC5L、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达均显著升高（P<0.05），E-钙粘蛋白表达显著降低（P<0.05），见图4、表6。

2.7  双荧光素酶报告基因检测结果

生物信息学分析显示，CDC5L的3'UTR含有miR-138-5p的结合位点，见图5A。与转染miR-NC相比，转染miR-138-5p mimic后，含有CDC5L-WT的荧光素酶报告基因的活性显著降低（t=22.862，P<0.05），而CDC5L-MUT的荧光素酶活性未受显著影响（t=0.645，P＞0.05），见图5B。

3  讨论

细胞周期调节在肿瘤恶性转化中起关键作用。因此，靶向细胞周期对于癌症治疗的研究越来越被关注[12-13]。CDC5L是有丝分裂进程的调节剂，参与了癌症进展，研究显示CDC5L的敲低诱导细胞周期停滞在G2/M期并减少肝细胞癌的细胞生长[14-15]；还可抑制膀胱癌[16]、结直肠癌[9]细胞的迁移和侵袭。CDC5L在胶质瘤中具有类似的作用。CDC5L的下调可抑制胶质瘤细胞的增殖，并诱导胶质瘤细胞凋亡[11]。

研究显示，胶质瘤组织中miR-138-5p的表达低于正常脑组织，其过表达会损害胶质瘤细胞的转移潜能[7]。因此，miR-138-5p在胶质瘤中主要充当肿瘤抑制因子。在本研究中采用miR-138-5p模拟物转染U251细胞上调miR-138-5p，结果显示，miR-138-5p

过表达降低了U251细胞的增殖活力，诱导细胞凋亡，且miR-138-5p过表达降低了U251细胞的侵袭能力，使用蛋白印迹法检测上皮间充质转化相关分子的蛋白水平，其中波形蛋白和N-钙粘蛋白显著减少，E-钙粘蛋白增加，表明miR-138-5p在胶质瘤的发展中起抑制作用。

miRNA通过直接与mRNA的3'-非翻译区结合来降解其靶mRNA或抑制蛋白质翻译[17-18]，其参与多种生物过程的控制，包括细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期进程[19-20]。有研究报道miR-138-5p可通过靶向端粒酶反转录酶抑制黑色素瘤中的细胞生长和侵袭[5]。通过在线生物信息学数据库（miRWalk、TargetScan、miRDB）预测发现，CDCL5是miR-138-5p的靶基因。考虑到CDC5L在细胞分裂周期中的作用及以往关于CDC5L在癌症中的报道，本研究选择CDC5L进行进一步研究，预测miR-138-5p和CDC5L的结合位点。本研究结果显示，采用RT-qPCR和蛋白印迹法测量CDC5L mRNA和蛋白水平，miR-138-5p过表达显著降低了CDC5L表达。流式细胞术结果显示，转染miR-138-5p模拟物后，U251细胞中CDC5L的抑制使细胞周期停滞在G2/M期。为了验证CDC5L是否为miR-138-5p的靶标，在U251细胞中进行了双荧光素酶报告基因测定，结果显示，用miR-138-5p模拟物和CDC5L-WT质粒共转染的细胞中荧光素酶活性降低。此外，本研究在miR-138-5p过表达的基础上，转染pcDNA3.1-CDC5L质粒以上调CDC5L表达，结果显示CDC5L的过表达反转了miR-138-5p对胶质瘤细胞增殖和侵袭以及诱导凋亡的抑制作用，且消除了G2/M期停滞，表明CDC5L是miR-138-5p在胶质瘤细胞中的下游功能效应物，miR-138-5p可通过CDC5L调节胶质瘤的进展。

综上所述，过表达miR-138-5p可能通过靶向下调CDC5L，诱导细胞周期停滞在G2/M期，从而抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。本研究不仅阐明了miR- 138-5p对胶质瘤的调节机制，而且为胶质瘤的诊断和治疗提供了新的推定生物标志物和治疗靶点，但miR-138-5p在临床实践中的应用价值仍需要深入研究。同时本研究尚存在几个局限性，如未在体内研究miR-138-5p的潜在机制等，因此后续将进行动物实验以进一步探索miR-138-5p在胶质瘤中的作用。

[参考文献]

• POONAN P， AGONI C， IBRAHIM M A A， et al. Glioma-targeted therapeutics： computer-aided drug design prospective[J]. Protein J， 2021， 40（5）： 601-655. 
• MWEEMPWA A， ROSENTHAL M A， DIMOU J， et al. Perioperative clinical trials for glioma： Raising the bar[J]. J Clin Neurosci， 2021， 89（1）： 144-150. 
• GAO K， WANG T， QIAO Y， et al. MicroRNA-30e-3p inhibits glioma development and promotes drug sensitivity to temozolomide treatment via targeting canopy FGF signaling regulator 2[J]. Cell Cycle， 2021， 20（22）： 2361-2371. 
• LIU C， GE Y Y， XIE X X， et al. Identification of dysregulated microRNAs in glioma using RNA- sequencing[J]. Curr Med Sci， 2021， 41（2）： 356-367. 
• TARAZ?N E， DE UNAMUNO BUSTOS B， MURRIA ESTAL R， et al. MiR-138-5p suppresses cell growth and migration in melanoma by targeting telomerase reverse transcriptase[J]. Genes （Basel）， 2021， 12（12）： 1931-1941. 
• ZHENG T， CHEN W， WANG X， et al. Circular RNA circ-FAM158A promotes retinoblastoma progression by regulating miR-138-5p/SLC7A5 axis[J]. Exp Eye Res， 2021， 211（1）： 108650-108689. 
• GONG J， TANG Z， YU Z， et al. miR-138-5p inhibits the growth and invasion of glioma cells by regulating WEE1[J]. Anal Cell Pathol （Amst）， 2022， 2022（1）： 7809882-7809893. 
• DENG Y， CHENG L， LV Z， et al. lncRNA SNHG7 promotes cell proliferation in glioma by acting as a competing endogenous RNA and sponging miR-138-5p to regulate EZH2 expression[J]. Oncol Lett， 2021， 22（1）： 565-573. 
• WANG K， LI B， FAN P， et al. Downregulation of DEAD-boxhelicase 21 （DDX21） inhibits proliferation， cell cycle， and tumor growth in colorectal cancer via targeting cell division cycle 5-like （CDC5L）[J]. Bioengineered， 2021， 12（2）： 12647-12658. 
• LI J， ZHANG N， ZHANG R， et al. CDC5L promoteshTERT expression and colorectal tumor growth[J]. Cell Physiol Biochem， 2017， 41（6）： 2475-2488. 
• CHEN W， ZHANG L， WANG Y， et al. Expression of CDC5L is associated with tumor progression in gliomas[J]. Tumour Biol， 2016， 37（3）： 4093-4103. 
• BARNABA N， LAROCQUE J R. Targeting cell cycle regulation via the G2-M checkpoint for synthetic lethality in melanoma[J]. Cell Cycle， 2021， 20（11）： 1041-1051. 
• MAHARJAN S， KWON Y S， LEE M G， et al. Cell cycle arrest-mediated cell death by morin in MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells[J]. Pharmacol Rep， 2021， 73（5）： 1315-1327. 
• QIUH， ZHANG X， NI W， et al. Expression and clinical role of CDC5L as a novel cell cycle protein inhepatocellular carcinoma[J]. Dig Dis Sci， 2016， 61（3）： 795-805. 
• HUANG R， XUE R， QU D， et al. Prp19 arrests cell cycle via CDC5L inhepatocellular carcinoma cells[J]. Int J Mol Sci， 2017， 18（4）： 778-786. 
• ZHANG Z， MAO W， WANG L， et al. Depletion of CDC5L inhibits bladder cancer tumorigenesis[J]. J Cancer， 2020， 11（2）： 353-363. 
• GUAN B， LI G， WAN B， et al. RNA-binding protein RBM38 inhibits colorectal cancer progression by partly and competitively binding to PTEN 3'UTR with miR-92a-3p[J]. Environ Toxicol， 2021， 36（12）： 2436- 2447. 
• MOHAMMADI M， SALEHZADEH A， TALESH SASANI S， et al. rs6426881 in the 3'-UTR of PBX1 is involved in breast and gastric cancers via altering the binding potential of miR-522-3p[J]. Mol Biol Rep， 2021， 48（11）： 7405-7414. 
• LIU Y， QU H C. miR-138-5p inhibits proliferation and invasion in kidney renal clear cell carcinoma by targeting SINA3 and regulation of the Notch signaling pathway[J]. J Clin Lab Anal， 2021， 35（11）： 23766- 23774. 
• BEVERIDGE D J， RICHARDSON K L， EPIS M R，     et al. The tumor suppressor miR-642a-5p targets Wilms tumor 1 gene and cell-cycle progression in prostate cancer[J]. Sci Rep， 2021， 11（1）： 18003-18016. 

（收稿日期：2022–09–08）

（修回日期：2023–02–06）