枳壳黄酮提取物抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖活性的研究

邱奕飞，张潇雪，肖国生，杜慧慧，杨东林

1.重庆三峡学院（万州 404120）；2.重庆文理学院创新靶向药物国际研究院（永川 402160）

枳壳为芸香科柑橘属植物酸橙（Citrus aurantiumL.）及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，含有丰富的活性成分，如生物碱、类黄酮、类柠檬苦素等，具有抗氧化、抗抑郁、抗炎和抗肿瘤等作用[2-3]。枳壳黄酮类成分含量是评价药材成熟度及质量优劣的关键指标[4]，黄烷酮和多甲氧基黄酮是其主要的黄酮类化合物。枳壳和枳实中主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，且不同品种的黄酮种类及含量存在显著差异[5-6]。据报道，枳壳提取物能够有效地清除DPPH自由基（最高可达59.89%），也可抑制细胞内ROS强度，起到良好的抗氧化效果[7-8]，还可降低小鼠体内的炎症因子IL-6，IL-1β和TNF-ɑ水平，起到抗炎作用[9-10]。但是目前并未有关于枳壳黄酮抑制肿瘤细胞增殖方面的研究。

常见的消化道癌症结直肠癌是全球高发癌症，2020年中国结直肠癌发病人数为55.5万，死亡人数为28.6万，分别占全球结直肠癌发病人数、死亡人数的28.8%和30.6%[11]。因此，结直肠癌严重威胁人类健康，是亟待解决的公共卫生问题之一。天然产物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到广泛关注。此研究以枳壳为研究对象，通过高效液相色谱法分析枳壳质量，并提取枳壳总黄酮，结合MTT试验和细胞凋亡试验分析枳壳总黄酮的抗肿瘤活性，以期为结直肠癌疾病的预防及治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枳壳（重庆市铜梁区子奇药业有限公司）；HCT116结直肠癌细胞（重庆文理学院创新靶向药物国际研究院）。

HPLC≥98%的柚皮苷对照品、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、青霉素、链霉素混合液（×100）、0.4%台盼蓝（美国Sigma公司）；HCT116细胞培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.05%胰酶-EDTA消化液（trypsin-ethylene diaminetetraacetie acid，EDTA）：美国Gibco公司；细胞培养瓶、96孔板（美国Corning公司）。Eppendorf AG高速冷冻离心机（德国）；奥林巴斯CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）；Countess 3细胞计数器（赛默飞世尔科技）；Cycation 5多功能酶标仪（美国BIO-TEK）；Accuri C6 流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）；GYXH-35台式实验室制冰机（厦门国仪科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 枳壳样本的采集

重庆枳壳（重庆市铜梁区子奇药业有限公司），选取未成熟青皮枳壳果实且表皮无明显伤痕，采收后切片去核，在60 ℃烘干12 h后备用。渝枳壳、川枳壳（网购），选取枳壳具体信息见表1。

表1 枳壳样品采集信息表

1.2.2 超高效液相色谱测定类黄酮含量分析

1.2.2.1 样品预处理

样品以5 000 r/min离心后，吸取2 mL上清液提取液置于10 mL容量瓶中，加甲醇，定容至刻度线，过0.22 μm亲水性PTFE膜到2 mL进样小瓶，待测。

1.2.2.2 色谱条件

参照Zhao等[12]使用UPLC-PDA系统（Waters USA）对PMFs和黄烷酮进行的测定和分析方法。具体方法：采用UPLC HC18色谱（2.10×100 mm，1.70 μm，UK），以0.01%（V/V）甲酸溶液（A相）和甲醇（B相）为流动相，梯度洗脱（0~0.6 min，10%~20% B；0.6~5 min，20%~70% B；5~7 min，70%~90% B；7~9 min，90%~10% B）；流速0.4 mL/min；柱温25 ℃；进样体积10 μL；检测波长283 nm（黄烷酮）。

1.2.3 枳壳黄酮提取物的制备

枳壳黄酮提取物参考刘飞[13]方法，并做出一定改进。称取1 g的枳壳粉末，过0.25 mm筛后加入到35 mL体积分数为90%的乙醇中，温度70 ℃，300 W，密封超声20 min。抽滤后取滤液，加入5 g预处理后的AB-8大孔树脂37 ℃振荡24 h（100 r/min），抽滤后取出大孔树脂，加入70 mL 75%乙醇，37 ℃振荡12 h（100 r/min）抽取留滤液。取出滤液，在50 ℃旋转蒸发至无酒精，呈悬浊液后停止旋蒸，最后滤液在-80 ℃冰箱冷冻6 h后使用真空冷冻干燥机冻干，置于-80 ℃冰箱待用。

1.2.4 结直肠癌细胞培养

取出冻存于液氮罐中的结直肠癌细胞HCT116进行常规复苏，即在37 ℃水浴锅中迅速完全融化，于800 r/min离心5 min，弃去上清液，将HCT116接种于含10%胎牛血清的McCoy’s 5 a培养基，置于培养箱中常规培养（37 ℃、5% CO2、饱和湿度），定期换液，待细胞生长融合达80%~90%时，取对数生长期的细胞进行试验。

1.2.5 MTT法检测肿瘤细胞增殖活性

取200 μL（1×103个/孔）对数生长期的细胞悬液接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的枳壳黄酮提取物和DMSO（阴性对照），使孔内终浓度为0，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200和400 μg/mL，并将细胞继续培养48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h，取出各组细胞，弃上清液后每孔加入200 μL DMSO，摇床10 min，酶标仪设定波长为570 nm，记录吸光度并计算枳壳总黄酮对细胞增殖的抑制率，每组设6个复孔[14]。细胞增殖抑制率按式（1）进行计算。

1.2.6 细胞凋亡检测

取对数生长期的HCT116细胞，按3.8×106个细胞接种于培养皿中，使用DMSO配制高浓度黄酮药物，过0.22 μm滤膜备用。接种细胞12 h后按照1∶200（高浓度黄酮药液∶培养基），使黄酮药物终浓度为0，100，200和400 μg/mL。在5% CO2、37 ℃、饱和湿度下孵育24 h 后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液离心（800 r/min，5 min）收集细胞于5 mL流式管内，然后用4 ℃的PBS洗两次，再使用100 μL 1×Annexinbinding buffer重悬细胞，接着加入5 μL FITC-Annexin V和2 μL PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min，最后加入400 μL 1×Annexin binding buffer，检测前放置于冰上。使用流式细胞仪检测，每组计数至少1×105个细胞，对照组和试验组均设置3个复孔，结果使用FLOWJO-V10软件分析。

1.3 数据分析

使用软件SPSS 20.0，GraphPad Prism 5进行数据处理，作图和分析，每组试验结果重复三次。数据以x±s表示。采用单因素ANOVA检验分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同来源枳壳黄酮含量分析

由表2可知，所测样本中渝枳二号柚皮苷含量大于7.5%，新橙皮苷含量大于5%，且总黄酮含量大于15%，有效活性黄酮类物质含量都高于其他样本。

表2 枳壳样品黄酮含量 单位：%

根据文献报道，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、芸香柚皮苷等黄酮类成分均具有较强的药理作用，均为枳壳的有效活性物质[14-16]。柚皮苷含量范围在0.23%~10.78%，新橙皮苷含量在0.17%~7.17%，橙皮苷含量在0.12%~3.45%，芸香柚皮苷含量在0.1%~3.62%。因此，可用这4个指标含量来评价枳壳的质量。根据公司检测标准和2020年《中国药典》筛选出一级枳壳进行活性物质提取。

2.2 枳壳黄酮提取物中总黄酮含量

此研究采用超声波辅助溶剂进行提取，继而用大孔树脂纯化并冷冻干燥得到枳壳黄酮提取物，其黄酮得率为11.82%，略高于用CA(OH)2法提取枳壳总黄酮的得率8.06%[17]，说明提取方法是可行的。

2.3 枳壳总黄酮对结直肠癌细胞活性的影响

由图1（A）可知，枳壳黄酮提取物能够抑制HCT116的增殖，呈浓度依赖关系。从表3可以看出：枳壳黄酮提取物质量浓度为1.56 μg/mL时，可显著抑制HCT116细胞的增殖（P＜0.05）；枳壳黄酮质量浓度大于6.25 μg/mL时，对HCT116细胞增殖的抑制作用显著性增强（P＜0.01），质量浓度为6.25~400 μg/mL时极显著地降低了HCT116细胞的增殖能力（P＜0.001），其中最高浓度抑制率为60.83%。此外，通过MTT实验测得枳壳黄酮抑制HCT116细胞的IC50值为317.2 μg/mL（图1B）。

图1 黄酮提取物对HCT116细胞活性的影响

表3 枳壳黄酮提取物对HCT116细胞的影响

2.4 枳壳总黄酮对结直肠癌细胞凋亡的影响

将枳壳黄酮提取物处理的HCT116细胞进行流式细胞仪检测，分析枳壳黄酮对HCT116细胞凋亡的诱导作用。通过流式分析发现，随着药物质量浓度上升，细胞凋亡率逐渐升高（图2）。对照组细胞在12 h后的早期凋亡率为1.4%，晚期凋亡率为11.2%。在处理组中，晚期凋亡率随黄酮提取物浓度的增加而有轻微增加，当400 μg/mL质量浓度处理12 h后晚期凋亡率达到13.7%，高于对照组，这与徐一鸣等[18]报道的类似。因此，枳壳黄酮提取物能够轻微诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性，这可能是提取物发挥抗癌作用的原因之一。

图2 黄酮提取物对HCT116细胞凋亡的影响

3 讨论

不同枳壳样品的有效成分存在较大的差异，同一产地不同采样时间和种植特性也会影响质量，民间多使用江西樟树、新干和重庆江津、綦江等较优品质的枳壳[19]。随着枳壳的引种栽培，如何保证枳壳的质量是关键问题。因此，需要建立高效快速的检测技术分析不同产地枳壳的活性成分的含量。根据2020年《中国药典》所规定，枳壳原药材、枳壳饮片与麸炒枳壳中柚皮苷含量不小于4%，新橙皮苷含量不小于3%。从所测不同批次、不同规格的枳壳样本来看，Y092与川枳壳两批枳壳柚皮苷含量不合格，Y540与Y660则柚皮苷、新橙皮苷含量均不合格。同时发现，网购的不同产地的枳壳样本中活性物质含量均较为低下。可见枳壳的质量与产地、种植方式、果实成熟度、运输保存方式等有着密不可分的关系。如随着枳壳果实成熟程度的增加果肉含量增加，果皮含量减少，其中柚皮苷和新橙皮苷的含量下降[20]。因此不同批次检测出柚皮苷与新橙皮苷的含量低可能与枳壳采收时期与品种有关。

枳壳中的化学组分较多，含有黄酮类、香豆素类，挥发油类等成分，具有抗菌、降血脂、抗肿瘤和抗抑郁等作用[21-23]，其中枳壳中的黄酮类化合物利胆、抗癌、抗病毒，且对多种肿瘤具有较好的抗肿瘤活性[24]。枳壳中的多甲氧基黄酮类物质能降低胃癌、肺癌、结肠癌、纤维瘤等肿瘤细胞活性，可作为抗癌物质开发[25-27]。据报道，川陈皮素以剂量和时间依赖性来降低口腔鳞状癌细胞活力，并能显著抑制肺肿瘤活性，减少肿瘤体积[28-29]。另外，枳壳中的柠檬素可改善直肠癌小鼠的免疫反应和炎症反应等[30]。此研究在枳壳总黄酮提取物在400 μg/mL处理48 h可最大限度地降低HCT116细胞生存率，可能与该浓度提取物处理48 h的细胞发生细胞凋亡升高有关，但细胞凋亡率上升幅度并不明显可能是处理时间过短的原因，后续可以进一步延长处理时间。

虽然枳壳的药理作用较多，但是相应的作用机制研究不深入，需要结合组学、网络药理学等技术深入探讨。除此之外，枳壳在保健食品的开发上较少，将活性成分应用于保健食品、药品也是亟待解决的问题，如枳壳多糖的免疫作用。

4 结论

通过高效液相色谱检测分析发现，不同枳壳样品的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和芸香柚皮苷的含量存在较大的差异，其中柚皮苷含量在0.23%~10.78%，新橙皮苷含量在0.17%~7.17%。22个样品中符合2020年版《中国药典》标准的有18个样品，合格率为81.8%。通过超声波辅助提取优质品种的枳壳黄酮，发现其对HCT116结直肠癌细胞具有显著抑制效果（P＜0.05）且呈量效关系，48 h内黄酮提取物（400 μg/mL）对结直肠癌肿瘤细胞的抑制率为60.83%，IC50值为317.2 μg/mL，细胞晚期凋亡率为13.7%。枳壳黄酮提取物能够抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖活性，为枳壳黄酮抗肿瘤活性的研究提供理论依据。