响应面法优化复合涂膜对鲜切苹果保鲜

武晋海，张苗靖，谢甜鸽，张新丽，田雪艳，朱志强

1.山西师范大学食品科学学院（太原 030000）；2.东北林业大学林学院（哈尔滨 150000）；3.钛和检测认证集团山西中谱安信质检技术服务有限公司（临汾 041000）；4.国家农产品保鲜工程技术研究中心，农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室（天津 300384）

我国是水果生产大国，产量稳居世界第一，2020年人均水果占有量达到了200 kg以上；水果富含维生素，是继谷物后碳水化合物摄入的重要来源。鲜果采后除直接食用外，鲜切和制汁等精深加工在满足居民多样性消费发挥了重大的作用。特别是随着我国农业和产业结构的调整及人民消费水平的提高、生活节奏的明显加快，鲜切水果产品逐渐形成产业化发展模式，拥有广阔的发展空间[1-3]。鲜切水果作为即时性食品，经切分等加工过程后，极易变色、变味等，从而大大降低消费口感和观感，如苹果切分后，机械创伤面在空气下祼露，真菌等微生物会快速侵入受损的苹果组织，利用蛋白质等营养成分而进行大量繁殖，造成品质不断下降，加速腐烂。如何抑制鲜切果蔬贮藏期品质的快速下降，筛选适宜的保鲜处理方式，减少其损失，对指导生产减损具有十分重要的意义。

壳聚糖常用于水果采后涂膜保鲜加工处理，但其不溶于水，需醋酸等酸性溶剂溶解，会对鲜切果蔬的风味产生不利的影响[4]。壳寡糖为低聚壳聚糖，具有水溶性极佳、成膜性良好且防腐抗菌能力优越的特点，同时它安全无毒、食用后不会对人体造成不良影响，在果蔬涂膜保鲜的应用中，是壳聚糖的良好替代品。目前，壳寡糖在果蔬如草莓[5-7]、梨果采后保鲜已有研究，对果蔬涂膜后的失重率、硬度、可溶性固形物和可滴定酸含量及贮藏品质的下降抑制作用显著[8-9]。将壳寡糖作用于鲜切果蔬并对果蔬贮藏品质影响的研究鲜有报道。乳酸菌素常用作食品天然防腐剂，多用于部分肉制品的防腐[10]，可以抑制食品中一些致病、致腐的革兰氏阳性菌，如霉菌等。茶多酚（SA）普遍存在于植物中，可明显抑制果蔬产生乙烯，有助于抵抗微生物，最终改善果实品质[11-14]，在樱桃、辣椒等上有研究效果显著。文章将以山西省吉县苹果为原料，采用可食用的乳酸菌素、壳寡糖、茶多酚三种天然防腐剂复合使用，以多酚氧化酶活性、黄酮、失重率为检测指标，经单因素试验后，通过响应面法优化三种试剂复合处理后对鲜切苹果的保鲜效果，避免单一使用无法较全面地解决果蔬保鲜过程中的污染问题[15-18]，以期为鲜切苹果贮藏期防腐保鲜提供优化方案，促进鲜切果蔬消费。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

苹果（山西省吉县）；蒸馏水，无水乙醇、磷酸缓冲液（pH 6.4）、邻苯二酚、三氯化铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、芦丁标准品、次氯酸（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；乳酸菌素、壳寡糖、茶多酚等均为食品级（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；聚乙烯（PE）保鲜膜（食品级，4 μm），超市购买。

1.2 仪器与设备

FA1204B分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-2数显恒温水浴锅（常州天瑞仪器有限公司）；UV-5100B紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

2 试验方法

2.1 苹果复合涂膜工艺

新鲜苹果→清洗消毒→切片→浸泡上膜→自然风干成膜→装袋→真空封口→4 ℃冰箱中储藏

2.2 单因素试验

2.2.1 不同浓度壳寡糖对多酚氧化酶活性的影响

定量称取壳寡糖，分别配制1%，15%和2%的壳寡糖溶液，搅拌至充分溶解，将挑选好的苹果进行清洗消毒，切片，再将挑选好的苹果片进行各浓度梯度保鲜涂膜处理浸泡5 min。待涂层自然风干，以保鲜膜封装，放入4 ℃贮藏，以水处理作为空白对照。开始贮藏后，每隔一天取出样品进行多酚氧化酶活性的测定，考察不同浓度壳寡糖对多酚氧化酶活性的影响。

2.2.2 不同浓度乳酸菌素对多酚氧化酶活性的影响

定量称取乳酸菌素，分别配制0.005%，0.01%和0.15%的乳酸菌素溶液，搅拌至充分溶解，将挑选好的苹果进行清洗消毒，切片，再将挑选好的苹果片进行各浓度梯度保险涂膜处理浸泡5 min，待涂层自然风干后，以保鲜膜装袋，放入4 ℃贮藏，以水处理作为空白对照。开始贮藏后，每过一天取出样品进行多酚氧化酶活性的测定，考察不同浓度乳酸菌素对多酚氧化酶活性的影响。

2.2.3 不同浓度茶多酚对多酚氧化酶活性的影响

定量称取茶多酚，分别配制1%，1.5%和2%的茶多酚溶液，搅拌至充分溶解，将挑选好的苹果进行清洗消毒，切片，再将挑选好的苹果片进行各浓度梯度保险涂膜处理浸泡5 min，待涂层自然风干后，以保鲜膜装袋，放入4 ℃贮藏，以水处理作为空白对照。开始贮藏后，每过一天取出样品进行多酚氧化酶活性的测定，考察不同浓度茶多酚对多酚氧化酶活性的影响。

2.3 响应面试验

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken进行试验设计[10]。以壳寡糖、乳酸菌素、茶多酚三个影响因素为自变量，每个因素取三个水平，以多酚氧化酶活性、黄酮、失重率为响应值，试验因素水平及编码设计见表1。通过软件Design-Expert 8.0.6对结果进行分析，建立二次回归方程，优化后得到数学模型。

表1 响应面因素水平表 单位：%

2.4 测定指标

2.4.1 PPO活性

将样品1 min内所测吸光度的0.01改变记为一动态活力单位（U）。配制酶提取液，并与磷酸缓冲液、邻苯二酚混合，在420 nm波长处测定反应混合液的吸光度（A）的变化并记录，以磷酸缓冲液调零，酶活力按式（1）计算。

式中：t为反应时间，min；W为所取鲜果质量，g。

2.4.2 总黄酮

绘制标准曲线[19]，确定适宜浓度范围，吸取样液或标准溶液于容量瓶中，加入蒸馏水、亚硝酸钠溶液、铝盐溶液，摇匀放置，加入氢氧化钠溶液，摇匀后用蒸馏水定容，测定500 nm吸光度（A500）。样品总黄酮含量以鲜质量计。

2.4.3 失重率

采用称重法测定。失重率按式（2）计算。

式中：m1为贮藏前样品质量，g；m2为不同贮藏期的样品质量，g。

2.5 数据处理

利用Design-Expert软件（Version 8.05 Stat-Ease Inc.MN，USA）对响应面试验结果进行线性回归和方差分析（P＜0.05）。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 不同浓度壳寡糖对鲜切苹果中多酚氧化酶活性的影响

由图1可知：随着贮藏时间的延长，鲜切苹果的多酚氧化酶活性均呈上升趋势，3 d后，CK，1%和2%浓度处理增加趋势明显增加，第6天时上升至最大值293，205和147 U。1.5%壳寡糖处理的苹果，多酚氧化酶活性上升趋势变缓慢且低于其他水平，第6天时上升至121 U，说明浓度的增加抑制多酚氧化酶活性作用增强。其中，1.5%浓度的壳寡糖溶液处理的苹果多酚氧化酶活性最低。第7天后均呈现出下降趋势，可能是因为适宜浓度的壳寡糖抑制了苹果的呼吸作用[20]，从而使多酚氧化酶活性低于CK及其他处理，从而保持了苹果品质。可见，壳寡糖在鲜切苹果的保鲜过程中浓度不宜过大，否则降低使用效果。

图1 不同浓度壳寡糖处理对鲜切苹果多酚氧化酶活性的影响

3.1.2 不同浓度乳酸菌素对鲜切苹果中多酚氧化酶活性的影响

如图2所示：不同浓度乳酸菌素处理过的鲜切苹果随着贮藏时间的延长，多酚氧化酶活性不断上升，第6天时达到最大值293，232，138和120 U，与CK相比，乳酸菌素溶液处理组多酚氧化酶活性呈较低水平，尤其0.01%浓度下乳酸菌素溶液组活性最低。此外，第6天后，各组均处于下降的趋势，下降趋势为CK＞0.005%＞0.015%＞0.01%。由上可知，由益生菌代谢产生的乳酸菌素表现出了明显的抑菌效果，其中0.01%抑制效果最明显，从而对鲜切苹果组织起到了保鲜、抗氧化作用。

图2 不同浓度乳酸菌素处理对鲜切苹果多酚氧化酶活性的影响

3.1.3 不同浓度茶多酚对鲜切苹果中多酚氧化酶活性的影响

图3表明：贮藏期间，多酚氧化酶活性呈不断上升趋势，CK，1%和2%浓度处理贮藏至第6天时上升至最大值293，222和144 U，且各浓度茶多酚处理下鲜切苹果中多酚氧化酶活性均低于CK，增长趋势也较为平缓。其中以1.5%溶液处理后的多酚氧化酶活性最低，第6天时上升至121 U，这与茶多酚的抑菌性密不可分[21]，极大程度上保持了苹果的品质。此外，从图3变化趋势来看，1.5%浓度茶多酚处理的苹果中多酚氧化酶活性在第7天仍然呈增长趋势，而2%浓度茶多酚处理的苹果中多酚氧化酶活性呈下降趋势。

图3 不同浓度茶多酚处理对鲜切苹果多酚氧化酶活性的影响

3.2 响应面试验结果与分析

3.2.1 响应面试验设计及结果

利用Design-Expert分析软件，采用Box-Behnken设计试验，依据响应面试验设计分别测定不同配比浓度下鲜切苹果的失重率、多酚氧化酶活性、总黄酮含量，结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

3.2.2 回归模型建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对表2中的试验数据进行二次多项回归拟合，3个因变量失重率（Y1）、多酚氧化酶活性（Y2）、总黄酮（Y3）经过拟合，得到回归方程，如式（3）~（5）所示。

结果显示，失重率（Y1）、多酚氧化酶活性（Y2）、总黄酮（Y3）3个响应值可通过线性模型进行拟合，对响应值建立的模型的决定系数R2分别为0.954 6，0.978 5和0.968 3，说明线性模型对上述3项检测指标响应值随乳酸菌素、茶多酚、壳寡糖三个自变量变化趋势的拟合度都较好，校正系数，失重率Radj2=0.933 7，多酚氧化酶活性Radj2=0.917 5、总黄酮Radj2=0.957 5，说明所选因素模型拟合度良好，可用于推测试验结果；多酚氧化酶活性变异系数（C.V.）= 9.13、总黄酮变异系数（C.V.）=5.77，说明模型重现性好。

3.2.3 因素分析

各配方的失重率、多酚氧化酶活性、总黄酮含量的回归模型方差分析结果见表3~表5。

表3 失重率回归模型方差分析

表4 多酚氧化酶活性回归模型方差分析

表5 总黄酮回归模型方差分析

涂膜处理在一定程度上降低了鲜切苹果贮藏期间的蒸腾作用，减少了果实水分的损失，不同涂膜处理的果实水分损耗程度不同[22]。从表3可以看出：根据F值大小可对A、B、C三种涂膜材料对失重率的影响排序：A＞B＞C，即乳酸菌素＞茶多酚＞壳寡糖；因素A对失重率有极显著影响，P＜0.01，差异极显著，失拟项P=0.056 6，差异不显著，这说明试验误差较小，一次项A的P值小于0.01，达到了极显著水平，交互项AB的P值＜0.05，达到了显著水平；A2、B2达到显著水平。

从表4可以看出：根据F值的大小可知A、B、C三种涂膜材料对多酚氧化酶活性的影响排序为C＞A＞B，即壳寡糖＞乳酸菌素＞茶多酚；因素C对失重率有极显著影响，P＜0.000 1，失拟项P=0.453 1，差异不显著，这说明试验误差较小，一次项C的P值＜0.01，达到了极显著水平，交互项AB的P值＜0.05；A2、B2、C2的P＜0.01，达到了极显著水平。

从表5可以看出：根据F值的大小可知A、B、C三种涂膜材料对总黄酮的影响排序为A＞C＞B，即乳酸菌素＞茶多酚＞壳寡糖；因素B、C对总黄酮有显著影响，因素A对总黄酮有极显著影响，交互项AC及二次项A2、B2、C2的P值＜0.01，达到了极显著水平。

3.2.4 响应面分析

响应面坡度陡峭程度和等高线图足够反映各因素对各指标的影响，坡度陡峭程度和等高线的形状均可反映出各交互作用的显著性。两因素交互项的三维图越陡峭，等高线呈椭圆则表明这两因素的交互项对响应面的影响越显著，反之，等高线近似圆形，则说明两要素交互作用不明显，相互影响较小[23-26]。

3.2.4.1 失重率

由图4可知，AB的等高线图为椭圆，说明交互作用对失重率的影响较大，在凹点处，失重率达到最低，保鲜效果最佳。回归方程模型的方差分析结果与响应面图反映的各因素之间交互作用结果一致。

图4 各因素交互作用对失重率影响的响应面图

3.2.4.2 多酚氧化酶活性

从图5可以看出，AB的等高线图为椭圆形，AB的交互作用对多酚氧化酶活性影响显著。回归方程模型的方差分析结果与响应面图反映的各因素之间交互作用结果一致。

图5 各因素交互作用对多酚氧化酶活性影响的响应面图

3.2.4.3 总黄酮含量

由图6可知，AC的等高线图为椭圆形，AC交互作用显著。回归方程模型的方差分析结果与响应面图反映的各因素之间交互作用结果一致。

图6 各因素交互作用对总黄酮含量影响的响应面图

3.3 响应面法优化涂膜条件的预测及验证

根据所得响应面数据，对上述3个多元回归方程用Design-Expert 8.0.6软件拟合优化，得到最优的涂膜条件：（1）乳酸菌素0.008 976%、茶多酚1.496%、壳寡糖1.602 5%，预测多酚氧化酶的氧化活性21.330 U；（2）乳酸菌素0.014 3%、茶多酚1.534 5%、壳寡糖1.5%，失重率4.518%；（3）乳酸菌素0.010 75%、茶多酚1.630 5%、壳寡糖1.573%，总黄酮6.155%。为便于实际试验的可操作性，修整其工艺：乳酸菌素0.01%，茶多酚1.5%，壳寡糖1.5%，在此优化条件下进行3次平行验证试验，失重率4.62%，多酚氧化酶活性19.75 U、总黄酮5.98%，与预测值相差不大，表明该配方可行。

4 结论

试验对鲜切苹果涂膜保鲜进行了研究，采用单因素试验及响应面试验，确定了复合涂膜的最佳配方：乳酸菌素0.01%，茶多酚1.5%，壳寡糖1.5%。此优化配方条件降低了失重率和多酚氧化酶活性、提高了总黄酮含量，复合涂膜处理对鲜切苹果具有更好的保鲜效果。此研究结果将为鲜切苹果的贮藏保鲜提供理论依据和技术支撑，复合涂膜在鲜切果蔬保鲜方面具有广阔的应用前景。