HPLC 法同时测定龙船花提取物中京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素的含量

徐娟，朱彩芳，曹旭

（1.镇江华康大药房连锁有限公司，镇江 212200；2.丹阳市中医院，镇江 212300；3.江苏吉贝尔药业股份有限公司，镇江 212009）

龙船花始载于《新修本草》，又名卖子木《新修本草》、红绣球《学圃杂疏》、五月花《生草药性备要》、映山红《本草求原》、大将军《广西中药志》、仙丹花《云南中药资源名录》及百日红《广西药用植物名录》等，其为茜草科植物龙船花Ixora chinensis Lam的花，味甘、淡，性凉，具清热凉血，散瘀止痛之功效，常用于高血压、月经不调、闭经、跌打损伤、疮疡疖肿的治疗[1]。本品于农历五月盛开红花，聚集如绣球，此时正是民间赛龙船之时，故称龙船花。本品富含挥发油、黄酮类、三萜类、甾体类及有机酸类等成分[2-4]。现代药理研究表明，龙船花具有抗肿瘤、镇痛、抗氧化、抗炎、抗妊娠及抗突变等药理作用[5-8]。本研究提取纯化工艺制备龙船花提取物，采用HPLC法同时测定提取物中京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素4 种成分的含量，为龙船花的保健食品及新药产品的开发奠定实验基础。

1 仪器与材料

Waterse 高效液相色谱仪（紫外检测器），旋转蒸发仪（上海亚荣），微量移液器（北京大龙），超声清洗机（昆山禾创超声），真空干燥机（上海仪昕），BAL 电子天平（赛多利斯）。京尼平苷酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111828-201805）、绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-202119）、山奈酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110861-202013）、异鼠李素（中国食品药品检定研究院，批号：110860-202012）。龙船花提取物（自制，批号：20220318、20220422、20220516），色谱纯乙腈（霍尼韦尔），纯化水（怡宝），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相组成0.15%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），按表1 进行梯度洗脱；流速：1 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量：10 μL；检测波长：260 nm。

表1 梯度洗脱Tab.1 Gradient elution

2.2 提取物制备

称取经烘干的龙船花药材适量，粉碎过50 目筛，加15 倍量水回流提取3 次，合并3 次提取液，减压浓缩至相对密度为1.30，加药用乙醇醇沉至含醇量达60%，静置18 小时，离心取上清液，减压浓缩至无醇味，采用D101 大孔吸附树脂进行吸附，依次用水、20%乙醇和40%乙醇洗脱以去除水溶性杂质及部分醇溶性杂质，用65%乙醇洗脱5 倍柱体积，收集洗脱液，浓缩干燥后即得。

2.3 样品溶液制备

2.3.1 对照品溶液配制

精密称取京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素对照品适量于量瓶中，稀释液（乙腈∶0.15%醋酸水溶液=80∶20）溶解并定容，配成含京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素分别为89.6 mg·L-1、236.9 mg·L-1、139.4 mg·L-1和177.8 mg·L-1的混合对照品溶液，备用。

2.3.2 供试品溶液制备

称取龙船花提取物100 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，用3 mL 65%乙醇超声溶解，稀释液定容，摇匀后即得，过0.45 μm 滤膜后备用。

2.4 方法专属性

按“2.1 色谱条件”下进样分析，得到混合对照品和龙船花提取物的HPLC 色谱图，见图1。在本实验色谱条件下，京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素的分离度良好，检测无干扰。

图1 混合对照品和龙船花提取物色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substance and the extract of Ixora Chinensis Lam

2.5 线性关系考察

吸取“2.3.1 对照品溶液配制”中混合对照品适量，稀释液定容得京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素浓度分别为2.24、4.48、8.96、22.4、44.8、89.6 mg · L-1、5.922 5、11.845、23.69、59.225、118.45、236.9 mg·L-1、3.485、6.97、13.94、34.85、69.7、139.4 mg·L-1和4.445、8.89、17.78、44.45、88.9、177.8 mg·L-1系列对照品溶液。按“2.1 色谱条件”进样并记录峰面积，并以峰面积（A）对对照品溶液浓度（C）进行线性回归，得京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素的回归方程及线性范围分别如表2所示。

表2 回归方程及线性范围Tab.2 Regression equation and linear range

2.6 精密度试验

精密吸取含京尼平苷酸8.96 mg·L-1、绿原酸23.69 mg·L-1、山奈酚13.94 mg·L-1和异鼠李素17.78 mg·L-1的混合对照品10 μL，按“2.1 色谱条件”重复进样6 次，记录各成分的峰面积，结果京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素峰面积的RSD 分别为1.57%、1.28%、1.39%和1.61%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

称取龙船花提取物（20220318 批）6 份，每份约100 mg，精密称定，按“2.3.2 供试品溶液的制备”配制供试品溶液，再按“2.1 色谱条件”下条件进样，记录京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素分别的峰面积，计算各自的测定结果。结果京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素在龙船花提取物的含量分别 为1.968 mg·g-1、6.149 mg·g-1、3.625 mg·g-1和4.513 mg·g-1，各成分的RSD 值分别为1.74%、1.55%、1.36%和1.42%。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一龙船花提取物供试品溶液，按“2.1色谱条件”分别在0，1，3，6，9，12，18，24，48 h 分别进样测定，记录京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素峰面积，结果京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素峰面积的RSD 分别为1.72%、1.80%、1.19 %和1.26%，表明供试品溶液在48 h 内稳定。

2.9 加样回收率试验

称取已知含量的龙船花提取物（20220318 批）6 份，每份约50 mg，精密称定，用3 mL 65%乙醇超声溶解，再加入5 mL 京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素为22.4 mg·L-1、59.225 mg·L-1、34.85 mg·L-1和44.45 mg·L-1的混合对照品溶液，于10 mL 容量瓶中，稀释液稀释定容。各样品均经0.45 μm 滤膜滤过，进样并记录峰面积，计算加样回收率及RSD 值，结果见表3。

表3 加样回收率结果Tab.3 Results of sample addition recovery

2.10 样品测定

精密称取3 个批次龙船花提取物，每批约100 mg，按“2.3.2 供试品溶液制备”制备供试品溶液，HPLC 进样分析，记录峰面积，分别计算龙船花提取物中京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素的含量，如表4 所示。

表4 样品中京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素的含量Tab.4 Content of geniposide，chlorogenic acid，kaempferol and isorhamnetin in the sample

3 讨论

我们将京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素对照品分别经紫外全波长扫描，结果京尼平苷酸在266 nm 波长处有最大吸收，绿原酸在273 nm 和326 nm 波长处有最大吸收，山奈酚在254 nm 波长处有最大吸收，异鼠李素在255 nm 和358 nm 波长处有最大吸收，经过实验比较，当检测波长为260 nm时，各色谱峰的峰型及分离度均良好。在选择流动相时，考察发现乙腈-水体系的基线相对平稳、峰型较好，且能较好地分离京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素四种成分，同时加0.15%的甲酸调整峰型，使峰型更优。

通过实验结果发现，龙船花提取物中绿原酸的含量最高（6.048 mg·g-1），其他3 种成分含量分别为京尼平苷酸（1.987 mg·g-1）、山奈酚（3.647 mg·g-1）和异鼠李素（4.442 mg·g-1）。长期研究证明，绿原酸在抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等领域具有良好的药理作用[9]，京尼平苷酸亦表现出优良的抗炎作用[10]，同时山奈酚和异鼠李素均被学者证明有较好的抗炎止痛作用[11-12]。这些也从侧面证明了龙船花自古就有记载的“清热凉血，散瘀止痛”的功效的合理性。

本研究建立HPLC 法同时测定龙船花提取物中京尼平苷酸、绿原酸、山奈酚和异鼠李素的含量，该方法简便、准确，重现性好，可用于龙船花提取物的质量控制与评价。由于本实验中研究对象仅为大孔树脂纯化后的提取物，成分种类较药材本身要精简，我们将进一步扩大基础性研究，以期获得更深入的发 现。