基于UPLC MS/MS 对盐酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔红霉素的质量控制

周雪飞，和燕玲，雒文军，李春燕，段光玉，卢静静，丁安平，吴春艳，张辉，邵伍军*

（1.浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000；2.台州科技职业学院，浙江 台州 318000）

表阿霉素又名表柔比星，是临床上重要的蒽环类广谱抗肿瘤药物，已广泛应用于多种肿瘤的治疗[1-2]。临床主要用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、恶性淋巴瘤等，其作用机制是直接作用于DNA 核碱对，干扰mRNA 的形成，抑制DNA 的合成和RNA的合成[3]。

14-溴-4'-表柔红霉素为盐酸表阿霉素合成工艺中脱羧酮反应产物，其结构与盐酸表阿霉素相似，含有基因毒性警示结构，根据ICH M7[4]，其TTC 为1.5 µg/day，而盐酸表阿霉素的最大日剂量为270 mg，因此14-溴-4'-表柔红霉素的限度为5.6 mg/ kg。由于表阿霉素为发酵类药物，其所含杂质较多[5]，而14-溴-4'-表柔红霉素的限度要求较低，普通高效液相色谱法专属性及限度很难达到要求，而液相色谱-质谱联用技术具有灵敏度高、专属性强、分析速度快、结果准确等特点，能够满足痕量毒性杂质测定的要求[6]。本文采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪（UPLC MS/MS），首次建立盐酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔红霉素的质量控制方法，报告限度为0.50 mg/kg，可以快速、简便、灵敏、准确地用来定量测定盐酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔红霉素含量[7]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY I UPLC Class-TQ-S micro 超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪（美国Waters 公司）。乙腈、甲醇均为市售色谱纯；甲酸为市售质谱纯；Milli-Q Advantage A10 超纯水仪（美国Merck 公司）；盐酸表阿霉素（浙江海正药业股份有限公司）。

1.2 对照品及样品配制

样品溶液：称取盐酸表阿霉素样品25 mg 于25 mL 容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，混匀。

14-溴-4'-表柔红霉素线性储备液：称取14-溴-4'-表柔红霉素对照品17.96 mg（含量76.2%）置于100 mL 容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，混匀；移取上述溶液1.0 mL 于100 mL 容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，混匀；移取上述溶液2.0 mL 于100 mL 容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，混匀。

14-溴-4'-表柔红霉素线性溶液配制：移取14-溴-4'-表柔红霉素线性储备液0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL 于5 个25 mL 容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，混匀。

定量限：分别移取14-溴-4'-表柔红霉素线性储备液0.5 mL 6 份于6 个25 mL 容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，混匀。

检测限：取第一份定量限溶液，移取3.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，混匀。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：采用Waters ACQUITY UPLC®BEH C182.1×100 mm，1.7 µm 色谱柱；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量3 µL；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈，梯度洗脱程序：0～ 4.0 min，20%～ 80% B；4.0～ 5.0 min，80% B；5.0～ 5.1 min，80%～ 20% B；5.1～ 7.0 min，20% B。

质谱条件：采用ESI+电喷雾离子源；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流速1 000 L/hr；毛细管电压3 kV；锥孔电压 35 V；采集模式MRM。质谱参数见表1。

表1 14-溴-4'-表柔红霉素多反应监测参数Tab.1 Multiple reaction monitorning（MRM）parameters for detection of 4'-epi-14-bromo daunorubicin

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

实验中考察了甲酸铵-甲醇、甲酸-甲醇、氨水-甲醇、甲酸铵-乙腈、甲酸-乙腈、氨水-乙腈等流动相体系，结果表明，使用乙腈作有机相时，14-溴-4'-表柔红霉素色谱峰峰型对称性较好，峰更尖锐，且洗脱能力高于甲醇；使用甲酸溶液作无机相时，14-溴-4'-表柔红霉素灵敏度高于氨水体系；使用甲酸铵缓冲盐作无机相时，14-溴-4'-表柔红霉素灵敏度与甲酸作无机相时相似。考虑到甲酸铵缓冲盐作无机相，对仪器的污染高于甲酸流动相体系，本实验最终选择0.1%甲酸水溶液和乙腈做流动相，进行梯度洗脱测定。

2.2 色谱柱选择

14-溴-4'-表柔红霉素结构与盐酸表阿霉素结构相似，盐酸表阿霉素USP 和EP 药典推荐使用C1 色谱柱，本实验选择粒径更小、柱长更短，分离度、柱效更高的超高效液相色谱柱Waters ACQUITY UPLC®BEH C182.1×100 mm，1.7 µm，梯度洗脱，总运行时间为7 min，14-溴-4'-表柔红霉素保留时间约2.8 min。

2.3 质谱条件优化

配制500 ng/mL 的14-溴-4'-表柔红霉素溶液通过蠕动泵直接注入质谱仪，在全扫描模式（Scan）下选择母离子606.10，优化毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气温度、脱溶剂气流速等，使m/z606.10 的响应值最高；在MRM 模式下选定母离子m/z606.10，优化合适的碰撞能量（Collision energy，CE）选取606.10/320.10、606.10/459.10 两个强度最大的子离子色谱峰，响应最高的子离子606.10/320.10 作为定量离子，响应次强的子离子606.10/459.10 作为定性离子。基于UPLC-MS/MS 分析的14-溴-4'-表柔红霉素的MRM 图谱见图1。

图1 14-溴-4'-表柔红霉素定量离子质谱图Fig.1 Quantitative ion chromatograms of 4'-epi-14-bromo daunorubicin

2.4 方法专属性

采用本实验方法，对空白溶剂、样品溶液、定量限溶液及检测限溶液进行检测，由图2 可知，样品溶液及空白溶液对14-溴-4'-表柔红霉素检测无干扰，专属性良好。

图2 专属性叠加图Fig.2 Overlay mass chromatograms of specifity

2.5 方法的线性、定量限及检测限

采用本实验方法对各线性溶液、定量限溶液、检测限溶液进行检测，以14-溴-4'-表柔红霉素浓度（ng/mL）和其对应的平均峰面积做线性回归曲线，得到浓度与峰面积的线性回归方程和相关系数。实验结果（表2）表明，本方法条件下14-溴-4'-表柔红霉素的线性关系良好，线性相关系数r=0.9999；定量限溶液信噪比（S/N）均≥10，定量限浓度为1.002 2 ng/mL；检测限溶液信噪比（S/N）均≥3，定量限浓度为0.300 7 ng/mL。

表2 14-溴-4'-表柔红霉素线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限Tab.2 Linear ranges，regression equations，correlation coeffients（r），limit of detection（LOD）and limit of quantitation（LOQ） of 4'-epi-14-bromo daunorubicin

2.6 精密度和准确度

在0.56 µg/g、5.60 µg/g、7.84 µg/g 的添加浓度下，盐酸表阿霉素样品中精密度溶液做6 个平行实验，准确度溶液做3 个平行实验。实验结果（表3）表明，14-溴-4'-表柔红霉素的回收率均在99.0%～ 101.3%，相对标准偏差RSD＜2%，该方法精密度和准确度良好。

表3 盐酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔红霉素精密度和准确度Tab.3 Sample precision and accuracy of 4'-epi-14-bromo daunorubicin in epirubicin hydrochloride

2.7 样品检测

采用本研究建立的分析方法，对盐酸表阿霉素3批原料药样品1060-D190701、1060-D190702、1060-D190703 进行检测，三批样品中均未检测到14-溴-4'-表柔红霉素，即小于检测限限度0.16 µg/g。

3 结论

本研究首次建立了超高效液相色谱-四级杆质谱联用技术对盐酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔红霉素质量进行研究的方法，该方法采用Waters ACQUITY UPLC®BEH C18（2.1×100 mm，1.7 µm）色谱柱进行分离，以0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，质谱采用正离子MRM 模式采集数据，流速为0.3 mL/min。经验证14-溴-4'-表柔红霉素的线性范围为0.547 4～ 10.948 4 ng/mL，相关系数r=0.999 9，方法检出限浓度为0.164 2 ng/ mL，定量限浓度为0.547 4 ng/mL，样品加标回收率在99.0%～ 101.3%。以上结果表明，该方法快速、简便、灵敏，可以准确地测定盐酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔红霉素的含量，同时为控制盐酸表阿霉素中14-溴-4'-表柔红霉素杂质提供技术支撑。