顶空气相色谱法测定苯磺酸氯吡格雷中的溶剂残留

徐克耐，唐海，杨洁

（江苏天士力帝益药业有限公司，天津 300410）

苯磺酸氯吡格雷是由韩国公司Hanmi Fine Chemical Co.,Ltd.开发的，用于治疗脑梗塞、心肌梗死等动静脉血栓、以及血小板聚集相关的疾病[1]。原研未在中国上市，且该品种已被欧洲药典收录。有文献报道了苯磺酸氯吡格雷中有关物质研究的研究情况。目前尚无文献报道苯磺酸氯吡格雷中溶剂残留的研究情况。

结合本产品的生产工艺情况，按照中国药典相关通则和ICH 指导原则的要求，并参考与氯吡格雷相关的溶剂残留文献[2-6]，建立一套合适的分析方法，用于控制本品的质量。

1 仪器

气相色谱仪 AgiLent 7890B 配有7697A 顶空进样器（安捷伦公司），DB-624（60 m×0.53 mm×3.0 μm，安捷伦公司），电子天平（梅特勒）。

2 试剂与试药

二甲基亚砜（DMSO，北京迪马欧泰科技发展中心，批号R141080，色谱纯），正丙醇（天津市元立化工有限公司，分析纯），二氯甲烷（天津市元立化工有限公司，分析纯），甲醇（德国Merck，批号I844007630，色谱纯），异丙醇（天津市元立化工有限公司，分析纯）、正庚烷（天津市化学试剂二厂，批号060215，色谱标准物）、丙酮（天津市化学试剂有限公司，批号20130313，分析纯）和乙酸乙酯（北京迪马欧泰科技发展中心，批号77998，色谱纯）。

内标：正丙醇（阿拉丁，分析标准品）

水：娃哈哈纯净水

苯磺酸氯吡格雷（自制，20201011，20201015，20201110）

3 方法

3.1 溶液配制

稀释剂：

二甲基亚砜：水=90∶10

对照溶液配制：

对照贮备液：取甲醇0.15 g、二氯甲烷0.06 g、异丙醇0.25 g、丙酮0.25 g、乙酸乙酯0.25 g、正庚烷0.25 g，精密称定，加空白稀释液定容至100 mL

内标贮备液：取正丙醇0.5 g 精密称定，加空白稀释液定容至100 mL

对照溶液：取1 mL 内标贮备液+1 mL 对照贮备液加空白稀释液定容至10 mL，制成每1 mL 中分别含甲醇0.15 mg、二氯甲烷0.03 mg、异丙醇0.25 mg、正庚烷0.25 mg、丙酮0.25 mg 的混合对照溶液。

样品溶液配制：

取本品约0.5 g，精密称定，加1 mL 内标贮备空白稀释液溶解并定容至10 mL，作为供试品溶液；分别取对照品溶液、供试品溶液2 mL 置于20 mL 顶空瓶中，密封。

3.2 色谱条件

3.2.1 顶空进样器

平衡温度为 80 ℃，平衡时间为30 分钟，分流比为5∶1，载气流速为4 mL/min

3.2.2 气相色谱条件

进样口温度：200 ℃；

检测器温度：250 ℃；

柱温：程序升温，升温如下：起始温度40 ℃，维持12 分钟，再以每分钟20 ℃的速率升温至60 ℃，维持12 分钟，再以每分钟40 ℃的速率升温至220 ℃，维持5 分钟。在上述条件下，取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液，分别进样分析，记录色谱图（图1），各有机溶剂色谱峰分离完全。

图1 苯磺酸氯吡格雷溶剂残留—专属性—混标Fig.1 Residual organic solvents in clopidogrel besilate-specificity-mixtured standard

4 结果

4.1 线性及范围

精密量取对照品贮备液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 分别置于10 mL 量瓶中，各精密加入内标溶液1 mL，加90%二甲基亚砜水溶液稀释至刻度，摇匀。分别取1 μL 注入气相色谱仪，记录色谱图，分别以甲醇、丙酮、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正庚烷对照品与内标峰面积的比值为纵坐标（A），甲醇、丙酮、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正庚烷浓度为横坐标（C），绘制标准曲线。线性及范围见表1。

试验结果表明，对照品在浓度范围内，线性关系良好，能满足后续试验的要求。

4.2 检测限、定量限

取线性测试项下的溶液逐步稀释，进样，测得结果见表2。

表2 检测限和定量限Tab.2 Limit of detection and quantification

试验结果表明，检测限和定量限的信噪比符合中国药典（四部，2020 版，9101 通则）分析方法验证的要求，能满足分析方法开发和样品测定的要求。

4.3 回收率

分别取本品约0.5 g，精密称定，置于10 mL 量瓶中（共10 份），精密加入贮备液0.8 mL（3 份）、1.0 mL（3 份）、1.2 mL（3 份），另取一份不加贮备液，作为空白对照，再精密加入内标溶液1 mL，加90%DMSO 水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀（共10 份），精密量取2 mL 置于20 mL 顶空瓶中，密封。注入气相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液同法测定，按内标法以峰面积计算，结果见表3。

表3 甲醇、丙酮、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和正庚烷的回收率试验Tab.3 Recovery of methanol,acetone,isopropyl alcohol,dichloromethane,ethyl acetate and n-heptane

回收率试验结果表明，回收率数据符合中国药典（四部，2020 版，9101 通则）分析方法验证的要求，能满足分析方法开发和样品测定的要求。

4.4 重现性

取对照品溶液按拟定残留溶剂测定法操作，重复进样6 次，分别取本品约0.5 g，精密称定，置10 mL 量瓶中，精密加入贮备液1.0 mL（6 份）再精密加入内标溶液1 mL，加90%DMSO 水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL 置于20 mL 顶空瓶中，密封。注入气相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液同法测定，按内标法以峰面积计算，结果见表4。

表4 叔丁基甲基醚、丙酮、四氢呋喃、甲醇、二氯甲烷、甲苯、吡啶、环己酮、乙酸的重现性试验（n=6）Tab.4 Reproducibility of tert-butyl methyl ether,acetone,tetrahydrofuran,methanol,dichloromethane,toluene,pyridine,cyclohexanone and acetic acid（n=6）

重现性试验结果表明，重现性数据符合中国药典（四部，2020 版，9101 通则）分析方法验证的要求，能满足分析方法开发和样品测定的要求。

4.5 中间精密度

按拟定残留溶剂检测方法，不同时间、不同检测人员在不同仪器上，对同一批样品进行精密度测定，两次测试的溶剂残留结果见表5。

表5 样品测定中间精密度Tab.5 Intermediate precision results of samples

测试一：GC1#气相、安捷伦FID 检测器测试二：GC2#气相、安捷伦FID 检测器

结论：拟定的残留溶剂检测方法中间精密度良好。数据符合中国药典（四部，2020 版，9101 通则）分析方法验证的要求，能满足分析方法开发和样品测定的要求。

4.6 溶液稳定性

供试品溶液在室温保存24 小时后测定，结果与原测结果基本一致，见表6。

表6 溶液稳定性结果比较Tab.6 Comparison of solution stability

试验结果表明，供试品溶液在24h 内始终保持稳定，没有生成其他杂质，符合中国药典（四部，2020 版，9101 通则）分析方法验证的要求，能满足分析方法开发和样品测定的要求。

4.7 耐用性试验

取系统适用性溶液、对照溶液、供试品溶液，各20 μL 进样，分别在顶空平衡温度、进样口温度、检测器温度、柱温和流速波动的色谱条件下测定，考察系统适用性以及药物含量的变化情况。

根据实验室现有条件，色谱柱厂家、型号与规格确定为安捷伦DB624（60 m×0.53 mm×3 μm）。其余考察条件见表7。考察结果见表8。

表7 耐用性条件Tab.7 Condition of robustness

表8 耐用性-溶剂残留测定结果Tab.8 Robustness-results of determination

结论：溶剂残留测定方法耐用性良好。符合中国药典（四部，2020 版，9101 通则）分析方法验证的要求，能满足分析方法开发和样品测定的要求。

4.8 样品测定

供试品溶液制备方法见“3.1 溶液配制”，共检测三批样品，检测结果表9。

表9 三批样品中溶剂残留情况（n=3）Tab.9 Results of residual organic solvents in three batches（n=3）

测定结果表明，样品中的溶剂残留情况符合ICH Q3C 中规定的限值，为合格产品。

5 讨论与展望

5.1 讨论

在预实验中，系统比较了HP-1，DB-1，HP-5，DB-5，DB-WAX 和DB-624 的分离效果，试验结果显示DB-624 分离效果好；通过前期预实验，苯磺酸不会干扰试验结果；预试验中发现，只以DMSO 作为溶剂，对顶空进样系统的管路污染比较严重，尝试过以DMF为溶剂，也会严重污染管路，经过反复试验，确定DMSO-水作为混合溶剂，没有出现管路污染的现象。

5.2 展望

后续还将深入研究苯磺酸氯吡格雷的有关物质、致突变杂质等，争取尽早把该产品推向市场，让患者早日享受到物美价廉的仿制药。该产品尽早上市，在给患者带来健康的同时，也会减轻患者的经济负担。