盐补骨脂饮片外表性状与内在质量相关性分析

肖伟香　孙宜春　刘娅琴　李慧馨　吴珊珊　林昶　杜洪志　侯晓杰　李玮

摘要［目的］考察鹽补骨脂饮片外观性状与内在成分含量之间的相关性，并筛选出对其质量具有重要影响性的内外指标。［方法］测定16批样品的千粒重、长度、宽度、厚度及粉末色度值（L*、a*、b*、E*），采用HPLC测定5种香豆素类、5种黄酮类及1种酚类的含量，并进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和相关性分析（CA）。［结果］ PCA表明新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂定、异补骨脂素、补骨脂素是影响内在成分综合排名（ICCS）的重要指标。OPLS-DA标记了6个重要指标，分别为千粒重、E*、补骨脂酚、L*、b*、ICCS。CA表明外观性状与内在成分含量存在差异，其中L*、b*、E*均与补骨脂苷、异补骨脂苷呈极显著正相关（P＜0.01），与补骨脂乙素呈显著正相关（P＜0.05），与补骨脂宁呈极显著负相关（P＜0.01）。a*与补骨脂苷呈极显著正相关（P＜0.01），与异补骨脂苷、补骨脂甲素、补骨脂乙素呈显著正相关（P＜0.05），与补骨脂宁呈显著负相关（P＜0.05）。［结论］综合3种分析方法得到盐补骨脂饮片外观性状特征以粉末色度值（L*、a*、b*、E*）为主要指标，内在成分以补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂宁、补骨脂酚为主要指标。

关键词盐补骨脂饮片；外观性状特征；内在成分含量；主成分分析；正交偏最小二乘判别分析；相关性分析

中图分类号R283文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）08-0194-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.045开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Correlation Analysis between External Appearance and Internal Quality of Salt-processed Psoralea corylifolia

XIAO Wei-xiang1，SUN Yi-chun2，LIU Ya-qin1 et al（1.College of Pharmacy， Guizhou University of Traditinal Chinese Medicine，Guiyang， Guizhou 550025;2. Sinopharm Tongjitang （Guizhou） Pharmaceutical Co.， Ltd.，Guiyang， Guizhou 550025）

Abstract［Objective］ To investigate the correlation between the quantification of appearance characteristics and the content of internal components in salt-processed Psoralea corylifolia， and to screen out the internal and external indicators that had important impact on their quality.［Method］ The 1 000 grain weight， length， width， thickness and powder chroma （L*， a*， b*， E*） of 16 batches of samples were determined，the contents of 5 coumarins， 5 flavonoids and 1 phenol compound were determined by HPLC， and principal component analysis （PCA）， orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） and correlation analysis （CA） were performed.［Result］PCA showed that neobavaisoflavone， bavachinin， psoralenoside， isopsoralenoside， psoralidin， isopsoralen and psoralen were important indicators affecting the comprehensive ranking of internal components （ICCS）. OPLS-DA marked six important indicators， which were the 1000 grain weight， the E*， bakuchiol， L*， b* and ICCS. CA showed that there were differences between the quantification of appearance traits and the content of internal components， among which the L* value， b* value and E* value were highly significantly positively correlated with psoralenoside and isopsoralenoside （P<0.01）， significantly positively correlated with isobavachalcone（P<0.05）， and highly significantly negatively correlated with psoralidin （P<0.01）. The value of a* was highly significantly positively correlated with psoralenoside （P<0.01）， significantly positively correlated with isopsoralenoside， coryfolin and isobavachalcone （P<0.05）， and significantly negatively correlated with psoralidin （P<0.05）. ［Conclusion］ By synthesizing the three analytical methods， the main indicators of the appearance characteristics of salt-processed Psoralea corylifolia are the chromaticity values （L， a， b， E）， and the main indicators of the internal components are psoralenoside， isopsoralenoside，coryfolin， isobavachalcone， psoralidin and bakuchiol.

Key wordsSalt-processed Psoralea corylifolia；Appearance characteristics；Internal components content；Principal component analysis （PCA）;Orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）;Correlation analysis （CA）

补骨脂为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实。盐补骨脂是通过净补骨脂盐炒所得［1］。补骨脂含有香豆素类、黄酮类、单萜酚类等化学成分，具有调节雌激素水平、抗肿瘤、神经保护及对心血管系统等方面有多重活性［2］。近年来，中药的外观性状与内在成分含量的相关性研究较多［3-6］，逐渐成为中药研究的热点，为其质量评价提供了新的方法。目前，主要从补骨脂药材指纹图谱和内在成分含量一测多评法的建立［7-9］和盐补骨脂饮片一测多评法的建立及其炮制工艺优选等方面［10-11］对补骨脂的质量进行评价，鲜有研究其外表性状与内在质量的相关性。该研究收集了16批盐补骨脂饮片，测定其外观性状特征值和内在成分含量，应用多元统计学方法进行分析，挖掘具有标志性的指标，为制定其质量评价体系提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料日本岛津高效液相色谱仪（LC-16，苏州岛津）；色差仪（NR-200型，Nscing Es/苏测）；补骨脂素对照品（批号66-97-7）、异补骨脂素对照品（批号523-50-2），购于贵州迪大生物科技有限责任公司；补骨脂苷对照品（批号905954-17-8）、异补骨脂苷对照品（批号90594-18-9）、新补骨脂异黄酮对照品（批号41060-15-5）、补骨脂甲素对照品（批号19879-32-4）、补骨脂宁对照品（批号53947-92-5）、补骨脂定对照品（批号18642-24-4）、补骨脂乙素对照品（批号20784-50-3）、补骨脂二氢黄酮甲醚对照品（批号19879-30-2）、补骨脂酚对照品（批号10309-37-2），均购于成都埃法生物科技有限责任公司；甲醇（色谱纯，天津科密欧）；乙腈（进口色谱纯，美国天地）；娃哈哈纯净水（贵阳娃哈哈昌盛饮料）；其余试剂均为分析纯。

该研究收购了16批盐补骨脂饮片，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实，样品信息见表1。

1.2试验方法

1.2.1外观性状特征测定。采用四分法筛选出一部分样品，随机选取1 000粒称重，即得千粒重；用游标卡尺测量样品长度、宽度和厚度。

1.2.2粉末颜色特征测定。取适量样品粉末（过3号筛），使用色度仪连续测量3次，查看并记录色度值。L值代表明亮度，0 ～ 100表示从黑色至白色；a代表红（+）绿（-）方向；b值代表黄（+）蓝（-）方向。根据公式总色度值E*=（L＋a＋b），计算样品的总色度值E［12］。

1.2.3内在成分含量测定。

1.2.3.1色谱条件。pntulipsBP-C Plus色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.3% 冰乙酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，15%B；5～35 min，15%～18%B；35～60 min，38% ～ 60%B；60～70 min，60%～95%B，70～75 min，95%～100%B），检测波长246 nm，温度20 ℃，进样量20 μL，流速1.2 mL/min。

1.2.3.2对照品溶液制备。分别精密称取补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂宁、补骨脂定、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚和补骨脂酚对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度分别为3.29、1.79、2.34、1.68、1.76、1.80、0.59、1.16、0.46、1.54、19.50 mg/mL的对照品储备液。

1.2.3.3供试品溶液制备。取样品粉末（过3号筛）0.25 g，置具塞锥形瓶中，加25 mL 70%乙醇溶液，称重，超声提取60 min，放冷，补足减失重量。滤过，备用。

1.2.3.4方法学考察。依据2020年版《中国药典》（四部）［13］分析方法验证指导原则进行方法学考察。以各待测成分峰面积的对数值（y）作为纵坐标、进样量的对数值（x）作为横坐标进行方程拟合，得到补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂宁、补骨脂定、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚和补骨脂酚的回归方程分别为y=2 674 060.62x-75 484.94（R=0.999 9）、y=3 173 628.77x-88 047.57（R=0.999 8）、y=7 366 040.95x+24 824.89（R=0.999 8）、y=7 326 364.86x-263 288.29（R=0.999 6）、y=4 299 851.84x+396 143.67（R=0.999 4）、y=2 214 904.83x+21 277.98（R=0.999 3）、y=7 626 885.09x-42 052.84（R=0.999 4）、y=2 421 031.89x+22 913.90（R=0.999 9）、y=1 511 043.71x+90 247.76（R=0.999 9）、y=1 779 439.25x+246 732.17（R=0.999 8）、y=1 165 021.42x+2 174 397.86（R=0.999 9），分别在0.20～6.38、0.14～3.51、0.33～2.39、0.37～2.79、0.39～2.82、0.18～1.44、0.12～0.34、0.37～1.73、0.26～1.95、0.71～2.16、5.01～24.01 μg進样量范围内与其峰面积的线性关系良好；精密度试验中，峰面积RSD均小于3%（n=6）；重复性试验中，各成分含量的RSD均小于3%（n=6）；稳定性试验分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，峰面积的RSD均小于3%；平均加样回收率分别为100.11%、100.10%、100.08%、99.93%、100.16%、99.97%、100.24%、99.99%、99.98%、100.32%、100.06%（n=6）。结果表明，该方法的精密度、重复性、准确性良好［14］。

1.2.3.5含量测定。精密吸取“1.2.3.3”供试品溶液20 μL，按照“1.2.3.1”色谱条件进行测定，分别计算补骨脂苷、异补骨脂苷等11个成分含量。补骨脂对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1。

1.3数据分析采用HemI 1.0.3.7-Heatmap Illustrator对样品粉末颜色进行可视化处理；采用JASP 0.14.1进行主成分分析；采用SIMCA 14.1进行正交偏最小二乘判别分析；采用SPSS 26.0软件进行相关性分析。

2结果与分析

2.1外观性状特征测定样品千粒重、长度、宽度和厚度的测定结果见表2。

2.2粉末颜色特征测定样品粉末色度值（L*、a*、b*、E*）的测定结果见表2。采用HemI 1.0.3.7-Heatmap Illustrator绘制粉末色度热点图如图2，说明样品间的色度值差异明显。

2.3内在成分含量采用HPLC测定16批样品中补骨脂苷、异补骨脂苷等11个内在成分的含量，结果见表3。从表3可以看出，样品中补骨脂素和异补骨脂素的总量为0.78～1.77 mg/g，符合2020年版《中国药典》［1］要求。对比香豆素类（补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定）、黄酮类（新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂宁、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚）和酚类（补骨脂酚）3类成分含量，发现酚类含量最高，其次是香豆素类，黄酮类含量最低。

2.4主成分分析以11个内在成分的含量为变量，通过JASP 0.14.1软件进行主成分分析（简称PCA），计算得到特征值及方差贡献率如表4所示。由表4可知，主成分分析特征值中前3个主成分的累计方差贡献率为80.40%，用这3个主成分对全部指标进行概括分析。由主成分与变量的模型图（图3）可知，第一主成分（RC1）中新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚的正向影响大；第二主成分（RC2）中异补骨脂苷、补骨脂苷的正向影响大，补骨脂定的负向影响大；第三主成分（RC3）中异补骨脂素和补骨脂素的正向影响大。

以3个主成分各自的方差贡献率为权重，通过分析得RC1的得分Y，RC2的得分Y，RC3的得分Y，构建综合评价模型，计算样品内在成分含量的综合得分（以下简称ICCS），ICCS=0.44Y+0.23Y+0.10Y，分别计算得到样品的ICCS并排名，见表5。样品S3排名第1，S14排名最后，产地均是云南省。表明同一产地不同厂家的盐补骨脂饮片内在质量差异明显。

2.5正交偏最小二乘判别分析采用SIMCA 14.1软件对16批样品全部指标进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），模型区分参数RX、RY分别为0.92、1.00，预测能力参数Q为0.73，表明模型稳定可靠，可用于评价样品质量［15］，得分散点图见图4。以样品粉末颜色深浅程度进行了分类，分为3类，S、S、S为第1类，总色度值E*为21.58～22.60；S、S、S、S、S、S、S、S、S、S為第2类，总色度值E*为18.39 ～ 20.82；S、S、S为第3类，总色度值E*为15.30～17.79。这3类样品的投影点相聚比较远，说明组间总色度值存在极显著差异（P<0.01）。

通过OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）可以初步筛选出组间差异成分，以VIP > 1为标准，如图5所示，共标记出6个贡献较大的成分，分别为千粒重（VIP=1.97）、E*（VIP = 1.82）、补骨脂酚（VIP = 1.65）、L*（VIP = 1.59）、b*（VIP = 1.44）、ICCS（VIP = 1.09）。以上6个指标是影响样品质量差异的标志性指标，其中，粉末色度值（L*、b*、E*）和千粒重是盐补骨脂饮片的重要外在特征指标，补骨脂酚和ICCS是内在成分的重要指标。

2.6指标之间相关性分析盐补骨脂饮片质量评价体系需要寻求外观性状与内在质量的相关性，采用SPSS 26.0软件对16批样品的内在成分与外观性状指标进行两两相关的Pearson相关性分析（简称CA），结果如表6所示。由表6可知，样品中千粒重、长度、宽度、厚度与内在成分均无显著相关（P>0.05）。样品中L*、b*、E*均与补骨脂苷、异补骨脂苷呈极显著正相关（P＜0.01），与补骨脂乙素呈显著正相关（P＜0.05），与补骨脂宁呈极显著负相关（P＜0.01）。a*与补骨脂苷呈极显著正相关（P＜0.01），与异补骨脂苷、补骨脂甲素、补骨脂乙素呈显著正相关（P＜0.05），与补骨脂宁呈显著负相关（P＜0.05）。结果表明，外观性状以粉末色度值（L*、a*、b*、E*）为主要指标；内在成分以补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂宁为主要指标。

3讨论与结论

中药传统性状鉴别主要通过感官评价，存在主观性较强且难以量化等缺点，采用现代相关检测设备将中药外观性状特征以数字化的形式表示出来，有助于更加客观准确地评价中药外观性状特征［16］。中药的“辨状论质”即根据药材外观性状所表现出来的特点，来判断药材的真伪优劣，从而阐明其本质，这就是“辨状论质”的涵义和依据。药材的外表性状与内在质量是有一定联系的［17］。

综合PCA、OPLS-DA、CA这3种分析方法，得到盐补骨脂饮片外观性状特征以粉末色度值（L*、a*、b*、E*）为主要指标，内在成分以补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂乙素、补骨脂宁、补骨脂甲素、补骨脂酚含量为主要指标。该研究挖掘出影响盐补骨脂质量的主要指标，为盐补骨脂饮片的质量体系提供了一定的理论依据。

在品质评价过程中，补骨脂具有肝毒性，有研究报道补骨脂素［18］、补骨脂二氢黄酮甲醚［19］、补骨脂酚［20］等具有肝毒性，但其又是药效的相关成分，是否将肝毒性纳入补骨脂品质评价中有待进一步研究。

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