化学发光法干扰素-γ释放试验在肺结核辅助诊断中的价值

盖林林 李海波 褚锦锦 孙家梅 闫心怡 杜金珂 代文清 徐栋花

（潍坊市人民医院中心实验室，山东 潍坊 261000）

结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的复杂性、慢性传染病，严重威胁人类的生命健康。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）全球结核病报告估算，全球约有1/3人口感染MTB；2019年，我国约有83.3万新发结核病病例[1-2]。结核病的发病机制复杂，患者临床表现、影像学特征多样，目前的实验室检验主要包括分子生物学、细菌学和免疫学方法，在敏感性和特异性上均不能满足临床需求，因此迫切需要一种快速诊断结核病的方法[3]。结核病是MTB在细胞内形成的一种迟发型过敏反应（Ⅳ型），检测MTB产生的特异性T淋巴细胞或可成为判断感染的新思路[4]。本研究采用化学发光干扰素-γ释放试验对潍坊地区183例肺结核确诊患者和33名健康体检者进行检测，进一步探讨该方法在肺结核快速诊断中的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2019年3月1日—2020年12月31日潍坊市人民医院住院的肺结核患者183例，根据活动性肺结核和非活动性肺结核的诊断标准[5]分为活动性肺结核组（109例）和非活动性肺结核组（74例）。另选取同期维坊市人民医院健康体检者33名（对照组），均无结核病病史、家族感染史，近6个月无活动性结核病患者密切接触史等。所有研究对象均无人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和严重的肝、肾功能损伤。本研究经潍坊市人民医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 化学法光法干扰素-γ释放试验检测

采集所有研究对象外周血5 mL（尽量空腹）于肝素钠抗凝真空管内，充分颠倒混匀，16 h内送检。将全血混匀后分别添加到本底对照管（N）、测试培养管（T）、阳性对照培养管（P）中，每个培养管加入肝素钠抗凝全血1 mL。将上述培养管颠倒混匀5～10次后，迅速放入37 °C培养箱中培养（22±2）h，将培养后的肝素钠抗凝全血以1 609×g离心10 min，采用化学发光法进行检测，试剂盒购自厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，检测仪器为Caris200全自动化学免疫分析仪（厦门优迈科医学仪器有限公司），根据试剂盒说明书要求判定结果。

1.2.2 血常规检测

采集所有研究对象外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用XN-2000全自动血液分析仪（日本希森美康公司）及配套试剂检测血常规。

1.2.3 结核菌素皮内试验

所有研究对象均进行结核菌素皮内试验。接种结核菌素纯蛋白衍生物（北京祥瑞生物制品有限公司）48～72 h后，观察硬结大小，以硬结>5 mm为阳性。

1.2.4 T-SPOT TB试验

采集所有研究对象外周静脉血5 mL，肝素抗凝，4 h内分离单个核细胞，洗涤2次，计数并稀释至2.5×105/mL；向包被特异性抗体的4个微孔中分别加入阴性对照（AIMV）、10 kD培养滤液蛋白（culture filtrate protein 10，CFP10）、6 kD早期分泌性抗原靶蛋白（early secretary antigenic target-6 kD，ESAT6）和阳性对照（植物血凝素）各50 μL，然后每孔加入稀释的单个核细胞悬液100 μL，置于37 ℃ 5%CO2培养箱温孵育16～20 h；洗板4次，再加入特异性抗体，4 ℃孵育1 h；洗板4次，加入显色液，37 ℃孵育7 min，加入蒸馏水终止反应；37 ℃烤箱10～20 min烤干，显微镜下计数斑点数。阳性结果判断标准：1）阴性孔斑点数为0～5个时，A或B孔斑点数≥6个，判定为阳性；2）阴性孔斑点数≥6个时，A或B斑点数≥2×阴性孔斑点数，判定为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，正态分布计量资料以±s表示，比较采用t检验；计数资料以率或例表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3个组一般资料比较

活动性肺结核组、非活动性肺结核组、对照组年龄、性别差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 3个组一般资料比较

2.2 3个组化学发光法干扰素-γ释放试验结果

活动性肺结核组化学发光法干扰素-γ释放试验阳性率最高（92.66%），3个组阳性率差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 3个组化学发光法干扰素-γ释放试验检测结果比较

2.3 不同方法诊断肺结核的效能

化学发光法干扰素-γ释放试验和T-SPOT TB试验诊断肺结核的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均高于结核菌素皮内试验，但仅敏感性差异有统计学意义（P<0.05），特异性、阳性预测值和阴性预测值差异均无统计学意义（P>0.05）。化学发光干扰素-γ释放试验敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均稍高于T-SPOT TB试验，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 不同方法诊断肺结核的效能 %（例/例）

2.4 活动性肺结核组干扰素-γ释放试验阳性和阴性患者外周血白细胞计数、淋巴细胞绝对值、淋巴细胞百分比检测结果比较

活动性肺结核组化学发光法干扰素-γ释放试验阳性和阴性患者外周血白细胞计数、淋巴细胞绝对值、淋巴细胞百分比差异均无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

2019年，全球约有1 000万结核病新增病例，且平均每年约有140万例患者死于结核病[6-7]。我国居结核病高负担国家的第3位，但近年来发病率呈逐渐下降的趋势[7-9]。早期诊断和及时治疗是控制MTB传播的主要措施。干扰素-γ释放试验是近20来年发展起来的检测特异性T淋巴细胞的技术，主要以MTB特有的RD1基因编码的ESAT6和CFP10作为刺激原来检测效应T淋巴细胞分泌干扰素-γ，因卡介苗和大多数非结核分枝杆菌无RD1基因，因此，该方法可有效区分卡介苗或大多数非结核分枝杆菌感染导致的假阳性结果。2006年，瑞士的抗肿瘤坏死因子α治疗前结核病筛查指南[10]肯定了干扰素-γ释放试验的作用，推荐对潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）患者可进行预防性治疗。2013年，美国开始采用干扰素-γ释放试验筛查LTBI[11]。目前，已经有16个国家将干扰素-γ释放试验列入结核病临床应用指南，用于结核病的辅助诊断，WHO也建议使用结核菌素皮内试验和干扰素-γ释放试验用于结核病的筛查[12]。

目前，化学发光法干扰素-γ释放试验因操作简单，可在采血后24 h内获得结果，误差小，易于标准化操作等优势，成为临床诊断MTB感染的主要方法。

本研究结果显示，3种方法中，化学发光法干扰素-γ释放试验的敏感性最高（92.66%），特异性为90.91% ，阳性预测值为97.12%，阴性预测值为78.95%。与王新宁等[13]和AI等[14]研究结果一致。本研究中，活动性肺结核组有8例患者化学发光法干扰素-γ释放试验检测为阴性，分别为4例肺恶性肿瘤化疗患者和1例咳嗽患者、1例乳腺癌脑转移患者、1例骨质疏松伴病理性骨折患者、1例肺炎性假瘤伴细支气管炎患者，假阴性原因可能与样本采集时间、机体发生细胞免疫反应的时间、机体自身免疫力、淋巴细胞的数量和质量等因素有关[15]。陈诚等[16]发现，干扰素-γ释放试验假阳性结果与陈旧性结核、肺癌等密切相关。本研究对照组中有3例假阳性，分别为1例肺恶性肿瘤术后、1例不明原因、1例既往感染者。提示对于化学发光法干扰素-γ释放试验假阴性和假阳性结果，临床应根据各种辅助检查和临床症状综合分析，以作出准确诊断。

本研究结果显示，化学发光法干扰素-γ释放试验阴性与阳性活动性肺结核患者之间外周血白细胞计数、淋巴细胞计数差异均无统计学意义（P>0.05），与马进宝等[17]和LV等[18]的研究结果不一致，可能与患者个体差异和淋巴细胞具体的免疫功能不同有关。

本研究尚存在一定的局限性：1）样本量相对较小，结果可能存在偏差；2）未对免疫功能受损患者进行分析。

综上所述，对于化学发光法干扰素-γ释放试验阳性的患者，应考虑结核病的可能。