XPC rs2228000位点多态性与乳腺癌发病的关系

李 牧 龚东亮 徐黎明 彭 荣

（1.复旦大学附属中山医院青浦分院检验科，上海 201700；2.复旦大学附属中山医院青浦分院骨科，上海 201700）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，寻找乳腺癌的危险因素和诱发因素，并加以控制，将对乳腺癌的防治起积极作用[1]。有研究发现，病变细胞必须以特异性的修复机制来进行修复[2]，而着色性干皮病基因组C（xeroderma pigmentosum group C，XPC）编码的蛋白在早期DNA损伤修复中起关键作用[3]。为进一步探讨XPCrs2228000（Ala499Val）位点多态性在乳腺癌中的作用，本研究拟采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）检测XPC基因，并分析XPCrs2228000位点多态性与乳腺癌发病的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年3月—2020年3月复旦大学附属中山医院青浦分院女性乳腺癌患者562例（乳腺癌组），年龄（43.0±9.4）岁。纳入标准：经组织病理学检查明确诊断为原发性乳腺癌。排除标准：1）合并其他肿瘤；2）不愿意参加本研究。另选取同期复旦大学附属中山医院青浦分院体检健康女性572名（正常对照组），年龄（45.0±10.2）岁。纳入标准：1）与病例无亲缘关系；2）体格检查和实验室常规项目（血常规、肝功能、肾功能等）检测均正常。本研究经复旦大学附属中山医院青浦分院伦理委员会批准（青医2022-59），所有研究对象均签署知情同意书，自愿完成流行病学调查。所有患者自愿提供术前、术后、化疗后的外周血样本。

1.2 方法

1.2.1 问卷调查

采用自主设计的问卷进行调查，收集所有研究对象的年龄、妊娠次数、分娩次数、婚姻状况等一般资料，收集乳腺癌患者的绝经情况、肿瘤类型、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、BRCA1基因表达情况等临床病理资料。

1.2.2 样本采集

采集正常对照者体检当日和乳腺癌患者术前1周、术后（化疗后）6周的空腹静脉血样本5 mL，-80 ℃保存备用。

1.2.3 仪器和试剂

全血DNA提取试剂盒、10×PCR Buffer、dNTP mixture、rTaqDNA聚合酶、10×T Buffer、限制性内切酶SacⅡ均购自日本TaKaRa公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。DNA marker购自天根生化科技（北京）有限公司。TOne 96 G PCR扩增仪（德国Biometra公司）。MF-ChemiBIS 3.2电泳凝胶成像分析系统（以色列DNR公司）。

1.2.4XPCrs2228000（Ala499Val）位点多态性检测

采用全血DNA提取试剂盒提取DNA。采用Primer 3.0软件设计DNA引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物为5'-TAAGGACCCAAGCTTGCCCG-3'，下游引物为5'-CCCACTTTTCCTCCTGCTCACAG-3'。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，10.0 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，rTaq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模版4.0 μL，ddH2O 11.0 μL。反应条件：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，63.3 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR-RFLP酶切反应体系：10×T Buffer 1 μL，0.1%牛血清白蛋白1 μL，限制性内切酶SacⅡ 0.5 μL，PCR 产物3 μL，ddH2O 4.5 μL。采用BeadXpress数码微珠芯片系统（美国Illumina公司）进行批量单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点检测，通过Sequenom Typer4.0软件（美国Sequenom公司）确定基因型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，2个组之间比较采用独立样本t检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Logistic回归分析评估XPCrs2228000位点多态性与乳腺癌发病的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组与正常对照组一般资料比较

乳腺癌组和正常对照组年龄、妊娠次数、分娩次数、婚姻状况差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 乳腺癌组与正常对照组一般资料比较

2.2 XPC rs2228000（Ala499Val）位点PCR扩增结果

PCR酶切产物经消化后在150 bp处产生特异性片段，见图1。

图1 PCR产物电泳图

2.3 酶切产物电泳结果

采用限制性内切酶鉴定基因型，结果显示，CC基因型在131 bp处有特异性条带，TT基因型在150 bp处有特异性条带。见图2。

图2 限制性内切酶酶切产物电泳结果

2.4 乳腺癌组和正常对照组XPC rs2228000位点基因型和等位基因分布频率比较

所有研究对象的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（乳腺癌组：χ2=0.038，P=0.781；正常对照组：χ2=1.512，P=0.237），具有群体代表性。

乳腺癌组和正常对照组CC基因型（野生型）、CT基因型（杂合型）、TT基因型（纯合型）和等位基因（C、T）的分布频率差异均有统计学意义（P<0.01）。见表2。

表2 乳腺癌组与正常对照组XPC rs2228000位点基因型和等位基因分布频率比较

Logistic回归分析结果显示，以CC基因型为对照，CT和TT基因型个体乳腺癌的发生风险显著增高[比值比（odds ratio，OR）值分别为1.36、2.44，95%可信区间（confidence interval，CI）分别为1.06～1.75、1.64～3.65]；以C等位基因为对照，携带T等位基因的个体乳腺癌的发生风险显著增高（OR=1.52，95%CI为1.37～1.94）。

2.5 XPC rs2228000位点多态性与乳腺癌患者临床病理参数的相关性

ER阳性、病理类型为浸润性导管癌的乳腺癌患者XPCrs2228000位点基因型分布分别与ER阴性、其他病理类型（浸润性小叶癌、原位癌等）的患者比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；不同年龄、绝经状态、PR表达、BRCA1基因表达的乳腺癌患者之间XPCrs2228000位点基因型分布差异均无统计学意义（P>0.05）。以其他病理类型（浸润性小叶癌、原位癌等）为对照，CT+TT基因型的乳腺癌患者病理类型为浸润性导管癌的风险增高（OR=2.3，95%CI为1.3～4.0）。以CC基因型为对照，CT+TT基因型的乳腺癌患者ER阳性的风险显著增高（OR=1.9，95%CI为0.8～2.5）。见表3。

表3 不同临床病理参数乳腺癌患者XPC rs2228000位点基因型分布比较

3 讨论

XPC蛋白可与紫外切除修复蛋白RAD23B形成异二聚体复合物[4]，在核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）的早期发挥作用，是核苷酸切除修复系统的重要组成部分[5]。有研究结果显示，XPC可与人源RAD23B重组蛋白相互作用，形成XPC-RAD23B复合物，激活p53抑癌基因，导致细胞周期阻滞，并在DNA识别和NER机制的启动中发挥重要作用[6-7]。XPC基因结构功能障碍可导致DNA修复能力降低，目前已被证实与肝癌、食管癌、胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的易感性相关[8-9]。

本研究结果显示，乳腺癌组与正常对照组基因型（CC、CT、TT）和等位基因（C、T）的分布频率差异均有统计学意义（P<0.01）；携带T等位基因的个体（CT+TT基因型）乳腺癌发生风险是携带C等位基因个体的1.52倍（OR=1.52，95%CI为1.37～1.94），携带CT和TT基因型的个体乳腺癌发生风险分别是携带CC基因型个体的1.36和2.44倍（OR值分别为1.36、2.44，95%CI分别为1.06～1.75、1.64～3.65）。提示XPCrs2228000（Ala499Val）位点多态性→T变异与乳腺癌发病有关。吴茵茵等[10]发现，XPCrs2228000位点多态性与乳腺癌发生无关，与本研究结果不一致。原因可能与地区、样本数量、基因之间遗传连锁不平衡和缺少其他肿瘤患者XPCrs2228000位点多态性研究等有关。

有研究结果显示，XPC基因会影响不同个体对DNA损伤的修复能力，从而影响患者恶性肿瘤的发生、激素水平和预后[11-12]。本研究结果显示，XPCrs2228000位点基因型分布与ER阳性和病理分型有关；以其他病理类型（浸润性小叶癌、原位癌等）为对照，CT+TT基因型个体发生浸润性导管癌的风险增高（OR=2.3，95%CI为1.3～4.0），且含等位基因T的个体所占比例较高（71.7%）。浸润性导管癌是乳腺癌的常见类型，表现为分化程度低，预后较差[13]。本研究结果还显示，XPCrs2228000位点多态性与年龄、绝经状态、PR、BRCA1等均无关（P>0.05），与文献报道[14-15]一致。但因随访时间较短，人群地域分布较集中，可能存在与其他未知功能性SNP之间连锁不平衡的偏差，本研究结果可能具有一定的局限性。

综上所述，XPCrs2228000位点多态性与乳腺癌发病有一定关系。