全血免疫抑制剂ID-LC-MS/MS候选参考方法的建立和性能评价

杨晓东 李全乐 潘清清 周 静 谢阳敏 邹继华 沈 敏 张 曼

（1.美康生物科技股份有限公司参考实验室，浙江 宁波 315104；2.首都医科大学附属北京世纪坛医院检验科，北京 100038）

免疫抑制剂是预防实体器官移植术后移植的器官或组织发生排斥反应的主要药物。环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司是临床实体器官移植术后最常用的免疫抑制剂[1]。这4种药物的药代动力学存在较大的个体内和个体间差异，治疗窗口窄，因此需进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM），以实现安全、有效、合理用药[2]。免疫抑制剂TDM常用的方法包括免疫法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法[3]。但免疫法交叉干扰大，准确度不高；液相色谱法检测时间长，稳定性较差[4]；液相色谱串联质谱法具有灵敏度高、特异性好、准确度高等优点，近年来已被广泛用于免疫抑制剂的TDM。由于不同方法的检测结果存在一定的差异，为了提高TDM常规检测方法的准确度，也为了帮助体外诊断（in vitrodiagnosis，IVD）行业满足国家监管机构要求的溯源性，建立参考测量方法迫在眉睫[5-6]。目前，检验医学溯源性联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）公布的免疫抑制剂参考方法基于同位素稀释质谱法原理，由TAIBON等[7]建立，采用固相萃取法对全血样本进行前处理，可同时检测全血中4种免疫抑制剂，但该方法检测时间较长，选用固相萃取法进行样本前处理，操作过程复杂，不可控因素较多。鉴于此，本研究拟采用蛋白沉淀法（protein precipitation，PPT）进行全血样本前处理，建立一种基于同位素稀释液相色谱串联质谱（isotope-dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）的简单、准确、稳定的全血样本4种免疫抑制剂测定候选参考方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

SHIMADZU LC-30A液相色谱仪+AB SCIEX QTRAP 5500串联质谱系统（美国SCIEX公司），accucore PFP 色谱柱（3.0 mm×50.0 mm，2.6 μm，美国ThermoFisher Scientific公司）。XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Heidolph Multi Reax漩涡混合器（德国Heidolph公司），ST 8R高速冷冻离心机（美国ThermoFisher Scientific公司）。Eppendorf移液器（德国Eppendorf AG公司），Hamilton气密性微量进样针（瑞士Hamilton公司），容量瓶（日本ASone公司）。Milli-Q超纯水系统（德国Millipore公司）。

有证参考物质他克莫司（货号T-049）、西罗莫司（货号S-015）、依维莫司（货号E-068）和环孢素A（货号C-093）购自美国Cerilliant公司；同位素内标西罗莫司-d3（货号10286）、依维莫司-d4（货号14001）购自美国IsoSciences公司，环孢素A-d4（货号D8710）购自美国Medical Isotopes公司，他克莫司-13Cd4（货号IR-14282）购自上海甄准生物科技有限公司；七水合硫酸锌购自德国Sigma公司；乙酸铵、甲醇、甲酸为质谱级，均购自美国ThermoFisher Scientific公司。实验用水采用Milli-Q超纯水系统制备。空白全血样本来自健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 标准品和内标制备

采用重量法制备他克莫司、西罗莫司和依维莫司浓度为10 μg/mL的混合标准储备液，环孢素A浓度为40 μg/mL的标准储备液，均用甲醇稀释制备，-20 ℃密封避光保存。精密称取不同质量的他克莫司、西罗莫司、依维莫司混合标准储备液和环孢素A标准储备液，制备5个浓度梯度的混合标准工作液（他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度均为50、20、10、5、1 ng/mL，环孢素A浓度为500、200、100、50、10 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。他克莫司、西罗莫司和依维莫司的校准范围为1～50 ng/mL，环孢素A的校准范围为10～500 ng/mL。采用重量法分别制备他克莫司-13Cd4、西罗莫司-d3、依维莫司-d4、环孢素A-d4的标准储备液，并以此为基础，制备混合内标工作液（他克莫司-13Cd4、西罗莫司-d3、依维莫司-d4浓度为20 ng/mL，环孢素A-d4浓度为200 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。

1.2.2 样本前处理

用重量法准确称取100 μL混合标准工作液或全血样本（全血样本在处理前-80 ℃冰冻至少10 min，以保证充分溶血），置于2 mL离心管中，加入100 μL混合内标工作液（重量法），然后加入300 μL甲醇与0.3 mol/L硫酸锌的混合溶液（V∶V=1∶1），旋涡混匀10 min，20 000×g离心10 min，吸取上清液，用亲水性针式过滤器（13.00 mm×0.22 μm，聚四氟乙烯）过滤，取150 μL滤液，加入带有玻璃内插管的进样瓶中，进样检测。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱为accucore PFP 色谱柱；流动相A为含有2 mmol/L乙酸铵的甲醇溶液，流动相B为含有2 mmol/L乙酸铵的水溶液，流速为0.45 mL/min，柱温为60 ℃，进样量为4 μL，梯度洗脱（0.0～1.0 min，40%B；1.0～3.5 min，0%B；3.50～3.51 min，0%～40%B；3.51～4.50 min，40%B）。

1.2.4 质谱分析条件

离子源为电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI），离子化方式为正离子模式，离子化电压为5 500 V，雾化温度为400 ℃，碰撞气强度为Medium，气帘气、雾化气和辅助加热气分别为25、40、40 psi。以多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式扫描分析。具体参数见表1。

表1 质谱测定参数设置

1.3 ID-LC-MS/MS候选参考方法性能评估

1.3.1 选择性和特异性

通过基质匹配双空白样本信号确认检测系统的背景噪音，并进行连续监测，以评估方法特异性和选择性。选取来源于5名健康志愿者的双空白（不含分析物和内标）全血样本，分别进行前处理后进样分析，获得全血基质下的总离子流图；分别提取每个分析物及其内标的选择性反应检测色谱图，若在每个分析物预期的保留时间处无任何基质干扰信号，且背景噪音较小，可认为方法具有良好的特异性和选择性。另外，通过监测定性离子对与定量离子对的离子丰度比来判断是否存在未知干扰物[8-9]。

1.3.2 基质效应

采用基质混合实验的方法检测相对基质效应。选取来源于5名健康志愿者的空白全血样本，按照加标的方式分别制备5个相同浓度的含药全血样本，然后通过检测5种混合基质样本[溶液基质样本（标准溶液）、全血基质样本和二者体积比分别为5∶5、8∶2、2∶8的混合物]中每个分析物与对应内标的峰面积比值来计算相对基质效应。如果3种混合物的相对基质效应<20%，则视为无相对基质效应[10-12]。

1.3.3 定量限

通过向空白全血样本中加入混合标准工作液的方式制备包括预期的定量限浓度在内的4个浓度梯度的样本，分别计算每个浓度梯度样本中每个分析物的理论浓度（C1），然后将不同浓度的样本各分10份进行前处理，上机检测，得到实际测定值（C2），将同时满足偏移<15%、变异系数（coefficient of variation，CV）<20%的浓度值定义为定量限[10-12]。

1.3.4 携带污染

在评估携带污染时，先重复进样低值（L）样本（定量限浓度样本），然后交替进样高值（H）样本（最高浓度的混合标准工作液）和低值样本，按如下顺序进样：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、H4、L5、L6、L7、L8、H5、H6、L9、H7、H8、L10、H9、H10、L11，比较第1次进样的低值样本后面跟随的低值样本检测结果均值A（即L2、L3、L6、L7、L8的检测均值）与随后进样的高值样本后面跟随的低值样本检测结果均值B（即L4、L5、L9、L10、L11的检测均值）的差异。携带污染率=（B-A）/A×100%。若低于预定标准（20%），则认为在测定该高值及以下浓度时不存在明显的携带污染[9-11]。

1.3.5 正确度

采用加标回收实验评估候选参考方法的正确度。用重量法分别将3个浓度梯度的混合标准溶液（他克莫司、西罗莫司、依维莫司低浓度均为100 ng/mL，中浓度均为500 ng/mL，高浓度均为1 000 ng/mL，环孢素A低、中、高浓度分别为1 000、5 000、10 000 ng/mL；用标准储备液按重量法制备）和空白全血样本按体积比1∶19制备3个浓度梯度的加标样本（浓度1：他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度均为5 ng/mL，环孢素A浓度为50 ng/mL；浓度2：他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度均为25 ng/mL，环孢素A浓度为250 ng/mL；浓度3：他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度均为50 ng/mL，环孢素A浓度为500 ng/mL），每个浓度样本重复测定5次，用加标回收率（测得量/加入量）考察候选参考方法的正确度，分别计算每个浓度加标样本的回收率[10-12]。

1.3.6 精密度

用加标的方式制备3个浓度梯度的质控样本（他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度分别为2.5、20、40 ng/mL；环孢素A浓度分别为25、200、400 ng/mL），每个浓度样本重复测定5次，连续检测3个批次，分别计算每个浓度质控样本的批内CV和批间CV[10-12]。

1.4 不确定度评估

依据Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement（GUM），从校准品制备、样本处理、仪器检测、重复测量4个方面分析不确定度来源[主要为样本测定的变异（不确定度A类评定）、有证参考物质浓度、天平校准因素（不确定度B类评定）]，计算合成不确定度，以扩展因子（k）=2计算扩展不确定度和相对扩展不确定度[10-12]。

2 结果

2.1 4种免疫抑制剂的校准曲线和线性范围

他克莫司、西罗莫司和依维莫司在1～50 ng/mL范围内，环孢素A在10～500 ng/mL范围内有良好的线性（r>0.999）。见图1。

图1 4种免疫抑制剂的校准曲线图

2.2 候选参考方法的选择性和特异性

双空白样本选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM）色谱图显示，在每个分析物预期的保留时间处无任何基质干扰信号，且背景噪音非常小，证明候选参考方法具有良好的特异性和选择性。典型的双空白样本SRM色谱图见图2，典型的样本总离子流色谱图见图3。

图2 典型的双空白样本SRM色谱图

图3 典型的样本总离子流色谱图

2.3 基质效应

采用基质混合实验考察相对基质效应，他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A的5份溶液基质样本峰面积比值的均值分别为5.556、2.132、1.318、2.102，5份全血基质样本的峰面积比值的均值分别为6.738、2.528、1.630、2.632，5份8∶2混合物样本峰面积比值的均值分别为6.560、2.456、1.584、2.580，5份5∶5混合物样本峰面积比值的均值分别为6.078、2.284、1.450、2.366，5份2∶8混合物样本峰面积比值的均值分别为5.688、2.200、1.386、2.352。他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A相对基质效应范围分别为0.08%～5.39%、0.02%～4.48%、0.99%～4.51%、0.71%～8.64%。4种免疫抑制剂不同比例混合物的相对基质效应均<10%，可视为无相对基质效应，即使存在基质效应，也会因同位素内标的存在而被校正。此外，通过监测定性离子对与定量离子对的离子丰度比，未发现存在未知干扰。

2.4 定量限

他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度为0.50、0.75和1.00 ng/mL，环孢素A浓度为7.50和10.00 ng/mL时，CV和偏移均满足要求。为了保证定量限的稳定、可靠，本研究设定他克莫司、西罗莫司、依维莫司定量限为1 ng/mL，环孢素A定量限为10 ng/mL。见表2。

表2 定量限样本检测结果

2.5 携带污染率

他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A的携带污染率分别为-1.87%、0.00%、-0.94%、1.48%，提示候选参考方法不存在明显的携带污染。

2.6 正确度

加标回收实验结果显示，他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A 3个浓度梯度的加标样本平均回收率为98.84%～100.99%，候选参考方法的正确度符合要求。见表3。

表3 他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A加标回收实验结果

2.7 精密度

他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A 3个浓度梯度质控样本的批内CV和批间CV均<5%。见表4。

表4 候选参考方法检测他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A的精密度

2.8 不确定度评定

候选参考方法测定人全血样本他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A浓度产生的不确定度较为合理。具体结果见表5。

表5 3个浓度梯度质控样本不确定度评估结果

3 讨论

他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A均可与红细胞结合，药物在红细胞和血浆之间的浓度比例超过30∶1，因此乙二胺四乙酸抗凝全血是最常用的样本基质[13]，然而，全血样本基质复杂，实现精准定量，就必须对整个检测流程的各个环节进行优化。LC-MS/MS检测全血样本他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢素A的过程涉及3个关键步骤：样本前处理、色谱条件和质谱条件。在样本前处理过样本时，由于全血样本黏度比较大，且均匀性较差，本研究将全血样本先-80 ℃冰冻至少10 min，然后平衡至室温，以保证充分溶血，从而将目标分析物从红细胞中分离出来，经冻融后的样本均匀性优于未经冻融处理的样本。本研究对蛋白沉淀剂中硫酸锌的浓度和硫酸锌与甲醇的比例进行优化，以达到最佳的蛋白沉淀效率；最后将高速离心后的上清液进行过滤，以减少基质的影响，从而得到纯净的进样样本，整个处理过程简单、省时。在色谱条件的选择上，本研究对色谱柱、流动相、柱温、流速、梯度洗脱程序进行了优化，在保证分析灵敏度的同时，减小了各种内源性干扰物质对目标分析物的影响。质谱条件的优化主要包括目标分析物母离子/子离子的选择、电压和碰撞能量的优化、离子源参数优化，使每个目标分析物都具有稳定且最佳的响应，确保检测性能的稳定可靠。

本研究参照相关文献[8-12]对建立的候选参考方法进行分析性能验证。在建立方法时，所有的溶液配制和样本移取均采用重量法。建立的候选参考方法检测环孢素A的线性范围为10～500 ng/mL，检测他克莫司、西罗莫司和依维莫司的线性范围为1～50 ng/mL；环孢素A的定量限为10 ng/mL，他克莫司、西罗莫司和依维莫司的定量限为1 ng/mL；定量限和线性范围完全能够满足常规检测的要求；相对基质效应≤8.64%，证实了同位素内标能够校正基质效应的影响。本研究精密度评价结果显示，不同浓度下的4种免疫抑制剂的批内CV和批间CV均<5%；环孢素A 3个浓度梯度的加标样本回收率平均为98.84%～100.56%，他克莫司、西罗莫司和依维莫司平均为99.04%～100.99%，精密度和正确度完全能够满足参考测量程序的要求。

综上所述，本研究建立的检测4种免疫抑制剂（他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A）的ID-LC-MS/MS候选参考方法具有操作简单、特异性强、准确度高、精密度好、分析时间短等优点，可用于他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A项目的量值溯源和标准化，在临床检测中具有实际价值。