以中草药为原料的新型抗病毒产品的制备

陈佩 胡小云

已知多种中草药具广谱抗病毒作用,尤其是清热解毒类中药,包括板蓝根、鱼腥草、金银花、穿心莲和野菊花等,对多种病毒具抑制作用,如呼吸道合胞病毒(HSV)、甲型流感病毒、单纯疱疹病毒和登革热病毒(DEN)等。这些药物的活性成分或直接作用于病毒,或通过调节机体免疫系统实现抗病毒作用。迄今为止,已报道的活性成分以化学物质为主,例如板蓝根中的靛蓝对HSV 具显著抑制效果；鱼腥草中的黄酮类成分可抑制多种病毒,其中金丝桃苷可有效抑制DEN；野菊花中的野菊花黄酮对人类免疫缺陷病毒(HIV)的抑制效率甚至高于病毒唑［1］。

MicroRNA 是一类内源性的、长度为21～25 nt 的单链小分子RNA,广泛存在于真核生物中,具高度保守性；在生物体内,microRNA 通过与mRNA 完全或不完全互补,在转录后水平发挥生理作用。从2002 年证实植物中microRNA 的存在以来,植物microRNA 领域研究进展迅猛。在药用植物领域,自从2015 年Zhou等［2］发现金银花来源的植物microRNA,miR2911 可通过口服途径进入动物体并抑制水痘-带状疱疹病毒的复制,植物microRNA 对动物体的“跨界调控”作用逐渐成为研究热点。多种药用植物中具跨界调控活性的microRNA 被发现。邵红伟等［3］报道,甘草miRNA 对人外周血单核细胞(PBMC)的生长具有促进作用,并能显著增加HLA-DR+细胞亚群的比例；Yang 等［4］发现,丹参中的Sal-miR-1 和Sal-miR-3 可在小鼠中调节OTUD7B/KLF4/NMHC ⅡA 轴,抑制血管重构。

然而,上述对具跨界调控活性植物microRNA 的研究皆属于对作用机理的探索,含活性植物microRNA 受试物的制备仅限于实验室规模,经验尚不能支持工业化规模生产,亦不清楚将活性植物microRNA 作为有效成分的工业规模产品在质量控制和有效性方面的可行性。本研究以含miR2911 的清热解毒类中药为原料,确立了一套以miR2911 为有效成分的新型抗病毒产品的制备工艺,并对以本制备工艺生产的产品进行了质量及稳定性研究,皆获得了积极结果。

1 材料与方法

1.1 样本中miR2911 含量的检测

1.1.1 样本处理 取1～10 g 样本,200 ml 沸水溶解,过滤后取50 μl 上清提取,600 μl 水洗脱。TRizol 法提取核酸。

1.1.2 实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR)条件 引物、探针序列：R ：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgg atacgactcccag；UR：agtgcagggtccgaggtatt；F：aatacggggga cgggct。

1.1.3 逆转录体系(共10 μl) dNTPs,1 μl;RNA 模板(1/1000),2 μl;HS-1R(1/500),1 μl;M-mlv,0.3 μl;(5×Buffer),2 μl;DEPC 水,3.7 μl。

1.1.4 qPCR反应体系(共20 μl) 2×SYBR Green Master Mix,10 μl；正向引物 (HS-1F1/500),1 μl；反向引物 (UR1/500),1 μl；模板DNA,2 μl；DEPC 水,6 μl。

1.1.5 反应程序 逆转录反应程序：(分段) 65℃5 min →4℃ 2 min →4℃+∞→42℃ 60 min →70℃10 min →4 ℃+∞。qPCR 反应程序：95 ℃ 5 min →40 循环(95℃ 10 s →60℃ 30 s →72℃ 20 s)→95℃15 s →60℃ 60 s →95℃ 30 s。

1.2 原料粉碎粒径研究 将原料采用手工磨碎、破壁机磨碎以及粉碎机粉碎等三种粉碎法制粉(粒径差异大),或将原料分别粉碎10、15、20、30 s 后,比较样本miR2911 溶出效果差异。

1.3 提取料液比研究 包括变料(原料)定液(提取液)和定料变液研究。将提取液体积固定,不断加大原料投料量,研究提取液溶出上限。然后,将原料投料量固定,研究不同体积提取液对提取的影响。

1.4 提取温度、方式和时间研究 其他提取条件不变,研究70℃热水、沸水两种提取温度条件对原料中miR2911 溶出的影响。同时,研究浸泡和煎煮两种提取温度维持方式下miR2911 溶出效果的差别。在选定上述两种条件后,研究0～12 min 提取时长范围内每延长2 min 对miR2911 溶出的影响。

2 研究结果

2.1 原料筛选 检测多种中草药饮片中miR2911 含量,参考各饮片中miR2911 含量进行原料筛选。检测数据显示：各饮片中miR2911 含量不同,其中金银花最高,野菊、绿茶、大青叶、桂花、黄柏等含量较高。选择miR2911 含量较多的饮片进行提取工艺研究。因绿茶来源多、有效成分变化较大,不利于质量控制,故舍弃。此外,甜菊叶是花草茶常用的调味剂之一,其所含甜菊糖具有高甜度、低热量的特点；且其含有较高水平的miR2911,即可能也具抗病毒活性,因此将其纳入配方中。候选组合配方包括：金银花、甜菊叶、野菊、大青叶、桂花。

2.2 提取工艺初步研究 基于金银花单方进行提取工艺初步研究,包括原料粉碎粒径、提取料液比及提取温度、方式和时间。

2.2.1 原料粉碎粒径 采用粉碎机粉碎、破壁机磨碎和手工磨碎的原料,miR2911 含量检测结果(MEAN CT：2.61、13.57、15.54)表明,粒径越细越容易溶出,结合生产可行性,暂定粒径≥200 目。

2.2.2 提取料液比

2.2.2.1 变料定液 将浸出液体积固定为200 ml,不断加大金银花投料量,研究浸出液溶出上限,结果显示200 ml 提取液,金银花投料上限约为5 g。保持此料液比不变,做6 倍的等比放大工艺研究,结果与前述结论基本一致,因此将金银花的投料上限暂定为4 g。见表1。

表1 变料定液

2.2.2.2 定料变液 在前期样本处理方法研究中,已发现当饮片粉末与纯水之比过高时,检测结果已超出PCR 方法的最适范围,导致无法继续研究,并测得料液比最高值为1∶20。在此,将金银花投料量固定为1 g,研究不同体积(100、200、400、800、1600 ml)提取液对提取效果的影响。结果(MEAN CT：23.78、22.89、24.39、25.05、26.40)显示,当料液比在1∶1600 范围内,样品检测有效,并能显示出浓度差异。但1∶1600时检测值接近水背景,不再予以考虑。1∶200～1∶100溶出基本稳定饱和。因此料液比设定在1∶200～1∶100,甚至更高程度为宜,但要低于1∶20。

2.2.3 提取温度、方式和时间 首先确认沸水相较于70℃热水的提取优势明显。结果显示,提取样本中miR2911 含量差异高达8～32 倍。然后,研究浸泡和煎煮两种方式下提取效果的差异。结果显示,两种方式下,miR2911 的溶出量并无差别。

在已选定的提取方法,即沸水浸泡的基础上,研究不同浸泡时长(0、2、4、6、8、10、12 min)对miR2911提取效果的影响；结果(MEAN CT：20.71、18.90、16.09、14.11、16.27、15.92、16.13)显示,浸泡时间＜4 min 时,对溶出有明显帮助。因此选取最佳浸泡时长为2～8 min。

2.2.4 提取工艺初步小结 基于金银花单种原料的提取工艺初步研究建立的条件包括：采用粉碎机粉碎,样本粉碎粒径≥200 目；金银花与浸出液投料比为1∶200～ 1∶20；沸水浸泡2～8 min。

3 提取工艺优化和确认

利用在饮片筛选时确定的候选组合配方,即原料包括：金银花、甜菊叶、野菊、大青叶、桂花,对上述初步提取工艺进行确认。基于结果2.2.1,进一步验证主要原料金银花在200 ml 提取液中的提取上限。保持野菊(1 g)和甜菊叶(0.1 g)重量不变,不同重量金银花(2、3、4、5、6 g)的组合配方,提取样本中miR2911 含量(MEAN CT)分别为19.00、19.11、17.31、18.24、19.92。结果显示,在组合配方中,金银花的最佳重量仍为4 g。基于上述结果,继续研究其他成分不同重量时的组合配方的miR2911 提取效果。结果显示,当金银花为4 g 时,甜菊叶0.1 g、野菊0.5 g、大青叶0.1 g、桂花0.2 g 的组合有效成分提取效果最佳。

称取配方为“金银花(4 g)+甜菊叶(0.1 g)+野菊(0.5 g)+大青叶(0.1 g)+桂花(0.2 g)”的组合原料,及配方为“金银花(4.9 g)”的单方原料,分别粉碎10 s后装入茶包中,加入200 ml 100℃的纯水,浸泡5 min后,对浸出液进行miR2911 的提取和检测,检测结果(MEAN CT：17.97、16.63)显示,组合配方优于单方。

采用上述组合配方的原料对提取工艺进行优化和确认,得到原料粒径20～200 目,原料与提取液投料比为1∶320～1∶20,温度在80～90℃,浸泡时间在5～10 min。

4 产品定型及质量研究

针对袋泡茶和饮料两种产品类型,进一步开展产品定型研究,主要包括灭菌工艺、调味、包装材料、使用方式等。

4.1 袋泡茶 基于提取工艺研究结果,以提取液中miR2911 含量到达顶峰为指标,选定配方为金银花4～8 g、甜菊叶0.1～0.2 g、野菊0.5～1.0 g、大青叶0.1～0.2 g、桂花0.2～0.4 g,即本品单位总重为10 g 左右,符合市场同类产品一般规格。浸泡时长5～10 min,提取液中miR2911 浓度最高。

4.1.1 冲泡体积 将选定配方的原料按经确认的工艺处理后,用不同体积(100、200、400、800、1600 ml)的沸水冲泡5 min 后,检测茶汤中miR2911 含量,结果(MEAN CT：17.85、17.72、20.79、22.26、23.08) 显示,200 ml 以内沸水冲泡可以保持稳定的近饱和状态,1600 ml 冲泡后浓度较低。

4.1.2 包装材料 调查市场常用的三种材质滤袋分别为无纺布滤袋、尼龙滤袋及滤纸滤袋,选取120 目左右的滤袋进行实验。各制备12 份茶包冲泡2 min,检测miR2911 含量,结果(MEAN CT：18.85、17.73、16.31)显示,尼龙滤袋效果最好,滤纸次之,无纺布效果最差。结合材质特征分析,认为三种材质皆可用作滤袋,其中优选孔径≥120 μm 的滤纸和尼龙滤袋,最优选为尼龙滤袋。

经用法及包材研究,最终选定配方为金银花4～8 g,甜菊叶0.1～0.2 g,野菊0.5～1.0 g,大青叶0.1～0.2 g,桂花0.2～0.4 g；用法为沸水200 ml,冲泡5～10 min,一次饮用；包材可为孔径≥120 μm 的滤纸和尼龙滤袋,最优选为尼龙滤袋。

4.1.3 稳定性 基于36 份袋泡茶产品进行检测,最终将出厂标准中的miR2911 含量定为＜16.79 CT+2 SD。

对袋泡茶产品进行4 个月的质量稳定性研究发现：前两个月袋泡茶含量稳定,第3、4 个月开始含量降低,考虑可能为系统背景降低导致的整体数据后移。因此,将袋泡茶产品的保质期定为2 个月。见表2。

表2 袋泡茶稳定性

4.2 饮料

4.2.1 灭菌工艺 考虑饮料一般采用后灭菌工艺,产品需经历高温高压过程,因此研究高温高压过程对miR2911 成份的影响,结果显示,在121℃高温高压灭菌条件下,制品中的miR2911 含量在0、3、5、10、20、30 min 时几乎没有变化。

4.2.2 调味 在饮料原液中加入A、B 两种风味添加剂调味,搅拌均匀后,检测miR2911 含量。结果发现,添加剂调味后对检测影响非常大,不能正常评估miR2911 含量(MEAN CT：A 风味,28.89;B 风味,28.57；水,23.80),因此饮料不添加食品添加剂。

4.2.3 稳定性 基于54 份饮料进行质量标准建立,最终确定饮料的出厂标准中miR2911 含量为CT 值＜17.84 CT+1.2 SD。对饮料进行3 个月的稳定性研究,确认饮料的保质期为3 个月。见表3。

表3 饮料稳定性

4.3 与市售产品的比较 将各种市售产品采用一次口服用量兑200 ml水溶解,饮片以1 g兑300 ml沸水粉碎。250 μl 提取,60 μl 洗脱,结果表明,金银花中miR2911含量有绝对优势,在市的食品/药品中仅××感冒通片具有可观含量,但是含miR2911 量至少较金银花饮片低10 倍以上,且与以本研究制备工艺制得的袋泡茶或饮料相比,miR2911 的含量都显著不足。见表4。

表4 市售产品miR2911 含量检测

5 讨论

经过一系列工艺研究,本研究确立了包括金银花的中草药单方和/或复方组合物为原料的提取工艺,以及袋泡茶和饮料产品的完整制备工艺。提取工艺参数主要包括：原料粒径20～200 目,原料与提取液投料比在 1∶320～1∶20 范围内,温度为80～90℃,浸泡时间为5～10 min。袋泡茶最终选定配方为金银花4～8 g,甜菊叶0.1～0.2 g,野菊0.5～1.0 g,大青叶0.1～0.2 g,桂花0.2～0.4 g；用法为沸水200 ml,冲泡5～10 min,一次饮用；包材可为孔径≥120 μm 的滤纸和尼龙滤袋,最优选为尼龙滤袋。饮料制备工艺采用中草药饮片复配提取、终端灭菌,不添加食品添加剂。以本研究制备工艺制得的袋泡茶和饮料产品,其miR2911 含量远高于市售产品,且可在2 或3 个月内保持质量稳定。

在本研究之前,药用植物中的microRNA 研究发现并证实了具跨界调控活性植物microRNA 的作用机理,提出了一套评估药用植物治疗活性的新理论。本研究基于这些发现和理论,首次研究了以具跨界调控活性植物microRNA 为活性成分产品的制备工艺,并证实了以本工艺制得产品的质量和稳定性优势,对上述新理论的实际应用具有重要意义。