纳米药物在肺癌免疫治疗中的研究进展

张辉标,唐东方,高文

复旦大学附属华东医院胸外科,上海 200040

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,同时也是老年人最好发的恶性肿瘤之一,每年导致近百万人死亡,其5年生存率小于20%[1-3]。不同阶段和病理类型的肺癌需要不同的治疗策略,目前手术、化疗和放疗仍是首选的一线治疗策略[4-6]。然而,手术和放射治疗都是局部治疗方法,主要针对原发病灶和局部浸润;而化疗的全身毒性和耐药性是其无法避免的问题,同时这些传统疗法对于老年患者的生存质量影响较大[7-8]。此外,一些针对肺癌的小分子药物也存在一定的缺陷,如血浆浓度峰值持续时间短、药物的靶向性差等,导致其临床应用的受限。

免疫疗法为恶性肿瘤治疗带来了革命性的变化,已经在一些肿瘤(如黑色素瘤、肺癌等)患者的治疗中显现出了一定的疗效。不过,值得注意的是,尽管一些免疫疗法是部分特定患者群体(特别是部分老年患者)的一线用药。但这些免疫药物,如抗程序性细胞死亡蛋白 1(anti-PD-1)的总体反应率仍较低、并存在全身毒性等不良反应[9-10]。因此,如何提高肿瘤抗原呈递率、如何提高肿瘤抗原呈递、增强免疫应答、克服免疫抑制、降低免疫毒性程度成为开发免疫药物的重点和难点。

纳米技术为药物开发、设计提供了巨大契机,同时也为肺癌治疗提供了新思路。纳米材料可通过增强渗透性和滞留性(EPR)效应有效提高肿瘤部位的药物浓度,具有降低全身毒性和增加给药剂量的功能[11-12]。此外,一些基于纳米药物的吸入治疗也是一种极具代表性的肺癌治疗模式[13]。吸入可将高剂量药物直接输送到肺部,减少全身分布和毒性,这类药物或许会为一般情况较差的晚期/老年肺癌患者延长生存期、改善生存质量带来一丝希望。目前,已经获批上市的用于肺癌治疗的纳米药物包有 Abraxane©(紫杉醇白蛋白纳米粒子)和Genexol©(紫杉醇 PEG-PLGANP 制剂)[14-15]。纳米医学在肺癌免疫治疗中的应用潜力也正不断被发现。在此,本文重点简述纳米材料在肺癌免疫治疗中的相关研究进展。

1 基于免疫检查点抑制纳米药物

在肺癌等肿瘤的病理状态下, PD-1、 CTLA-4、 LAG-3和TIM-3等几种免疫检查点分子会在T细胞上表达,这被认为是一类T细胞衰竭的标志。一般来说, T细胞激活分为两步,首先是通过T细胞受体识别MHC呈递的肽抗原,然后进一步通过抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APCs)的B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)连接T细胞的CD28。CTLA-4的结构与CD28相似,可以与CD80和 CD86相互作用,但与CD28相比具有更大的亲和力。另一方面,表达在 T 细胞上的 PD-1 与表达在肿瘤细胞上的 PD-L1/L2 结合会导致 T 细胞发出抑制信号[16-17]。由于这些免疫检查点活性上调,耗竭的 T 细胞在对抗入侵细胞时而功能失调。肿瘤利用这一缺陷,诱导免疫检查点衍生的信号通路来抑制 T 细胞的抗肿瘤功能[18-20]。目前最受认可的基于免疫检查点的免疫疗法是使用免疫检查点抑制剂(ICIs)。目前,免疫检查点机制多集中于CTLA-4 和 PD-1,并进行了大量的研究和分析。这两种机制以不同的方式在不同的水平上抑制 T 细胞的活化。然而,目前的ICIs的大量的临床实验以及临床应用中仍存在一定的问题。例如, PD-1/PD-L1抗体由于结合或抑制效果不足而受到疗效限制;在治疗后,免疫检查点分子表达不均匀,配体重新分布,导致总体应答率较低,仅为20%～40%[21]。因此,一些基于纳米载体的ICIs也不断被开发并尝试在临床应用,以克服现有ICIs的治疗弊端,提高治疗疗效。

1.1改善ICIs药物在肿瘤内摄取度目前的多数PD-1/L1免疫药物通常缺乏靶向递送能力,常常导致治疗效果低,毒性严重。此外,肺癌的异质性和肿瘤微环境的复杂性阻碍了药物在临床中的广泛应用。通过构建具有特异性和靶向功能的纳米载药体系,旨在减轻免疫反应的细胞工程技术,通过增强免疫药物的靶向能力和血液浓度,来增强在癌症免疫治疗中的应用是一种有潜力的策略。生物仿生细胞膜包覆的数控材料因其配体识别性强、血液循环时间长、免疫避避能力强等特点成为药物输送系统的热点[22]。各种合成纳米材料(如聚乳酸共聚乙二醇、介孔二氧化硅、成像剂)与药物和核酸等治疗剂可被封装在各种来源的细胞膜中[23]。由于细胞膜上存在的各种配体,这类细胞膜,如红细胞膜、肿瘤细胞膜、免疫细胞膜等,具有内在一定的独特性,如免疫原性和天然靶向性等。因此,基于细胞膜的纳米药物可能是提高药物富集、增加疗效的有效策略。

Yimin Zhu团队[24]利用肺癌H460细胞膜包覆超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO NPs),并将将TPP1肽偶联到SPIO表面NP@M,制备SPIO NP@M。在TPP1和DSPEPEG之间插入金属基质蛋白酶2 (Metallomatrix protease 2, MMP2)底物短肽(-PLGLLG-),可悲肿瘤内的MMP2识别并切断,从而将TPP1肽从SPIO NP@M释放到肿瘤微环境中。这种新型的PD-L1抑制肽递送纳米药物能有效延长肽的半衰期(比单独使用肽的半衰期长60倍),并能在体外和体内保持重新激活T细胞和抑制肿瘤生长的能力。这不仅证明了这类基于细胞膜的递送系统具有低毒性、靶向释放和体内循环寿命长的优点,从而显示出作为肿瘤PD-L1免疫治疗的优越纳米平台的潜力。

1.2缓解免疫药物毒性磷酸激酶 1(Polo-like kinase 1, PLK1)是一种关键的有丝分裂激酶,研究表明PLK1的表达有助于免疫抑制性 TME,抑制免疫细胞浸润和抗肿瘤免疫[25]。在 NSCLC 中, PLK1 的表达与免疫评分、主要组织相容性复合体(MHC)I 类活性和 TILs 的表达呈负相关。抑制 PLK1 可降低 STAT3 的磷酸化,从而抑制其在 NSCLC 细胞中的活性。此外, PLK1 抑制还可增加多种细胞系中 MHC-I 表达,表明其在适应性免疫中也具有一定作用[26]。目前已有几种 PLK1 小分子抑制剂进入临床试验阶段。然而,由于剂量限制性毒性和单药疗效不佳, PLK1 抑制剂的临床应用尚未实现。

Moataz Reda等[27]报道了一种一种名为ARAC(抗原释放剂和检查点抑制剂)的纳米免疫疗法,用于联合递送PLK1 抑制剂(volasertib)和 PD-L1 抗体。ARAC 以聚合物包覆介孔二氧化硅纳米粒子作为纳米载体。在侵袭性转移性肺肿瘤模型中, ARAC递送PLK1抑制剂(volasertib)和PDL1抗体可以将有效药物剂量减少5倍。这大大降低了每种药物的毒性问题,同时实现了两种药物的治疗协同作用。ARAC中通过抑制PLK1诱导癌细胞死亡,同时也上调存活癌细胞的 PD-L1表达;这使得肺癌对ARAC上PD-L1抗体阻断PD-1/PDL1反应更灵敏。细胞通过内吞作用摄取 PD-L1结合的ARAC也会降低膜PD-L1的表达水平,使癌细胞进一步受到细胞毒性T细胞的攻击。这项研究将通过构建新型的纳米免疫药物,将协同PLK1抑制剂和PD-L1抑制剂治疗作为一种肺癌免疫潜在的治疗选择,并体现出了利用纳米粒子平台作为递送载体可以在不增加毒性的情况下增强现有协同靶向药物疗法疗效的优势。

整合素β3(β3-int)在脊柱转移的非小细胞肺癌(NSCLC-SM)中明显上调[28]。其抑制剂RGDyK可促进PD-L1泛素化,提示RGDyK作为一种新型的PD-L1纳米抑制剂和治疗NSCLC-SM的靶向肽具有潜在的应用前景。Lei Zhou等[29]制备了一种RGDyK修饰和负载原卟啉锌(ZnPP)的介孔硅纳米颗粒(ZnPP@MSN-RGDyK)。ZnPP@MSN-RGDyK纳米颗粒精确靶向β3-int并抑制PD-L1表达,同时可以通过除了通过光敏剂(如原卟啉锌, ZnPP)产生活性氧(ROS) 直接杀死肿瘤细胞、促进肿瘤特异性抗原释放,增加T细胞含量。在NSCLC-SM小鼠模型的治疗结果显示, ZnPP@MSN-RGDyK不仅可以提高光动力治疗效率,同时可以降低免疫药物用量的同时显示出相当的免疫疗效。

2 基于巨噬细胞(TAM)的纳米药物

巨噬细胞存在多种表型,一端是抗炎(M2)表型,另一端是促炎经典(M1)表型。TAMs主要是M2表型,它通过诱导免疫抑制、血管生成和转移来帮助肿瘤发生[30-31]。在NSCLC中,高达70%的TAMs可能是M2巨噬细胞。多项研究表明, NSCLC组织中的M1巨噬细胞含量与患者的存活时间有关[32]。因此, TAMs从M2表型向M1表型的再极化有助于提高NSCLC治疗药物的抗肿瘤疗效。

某些微小RNA(miR),如miR-125b,可将巨噬细胞重编程为抗肿瘤/炎症(M1)表型。Mansoor M. Amiji教授团队[33]使用了非免疫原性的,可生物降解的,非炎症性的透明质酸(HA) 纳米颗粒构建了miR-125b的递送系统。其利用阳离子聚(甲基亚胺)(PEI)修饰了HA 骨架,以促进miR封装到自组装的HA-PEI纳米颗粒中。腹腔注射后,这些HA-PEI自组装纳米颗粒可以迅速被腹膜巨噬细胞吸收。利用腹腔巨噬细胞向炎症/损伤部位迁移的固有能力,腹腔注射HA-PEI 纳米粒子后在KRAS/p53双突变基因工程(KP-GEM)NSCLC小鼠的巨噬细胞损伤肺组织中聚集。此外,接受HA-PEI治疗后的小鼠, TAMs 中巨噬细胞的M1与M2比率增加了6倍以上, iNOS(M1标记)/Arg-1(M2标记)比率增加了300倍。这些研究结果表明,经静脉注射的巨噬细胞特异性HA-PEI纳米颗粒可成功转染小鼠模型肺组织中的TAMs。同时,这种TAM向M1表型的成功再极化对肺癌免疫疗法具有重要意义。

3 基于TLR9的纳米药物

Toll样受体(TLR)激动剂是一种能够诱导先天性免疫反应和控制适应性免疫的免疫调节剂,在临床开发的早期阶段作为抗癌分子已经受到了研究者们的关注[34]。TLR9位于人B细胞、浆细胞样树突状细胞(pDCs)、单核细胞、单核细胞源性巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞(NK)的内体中[35]。B类CpG (CpG-B)是一种有效的pDCs和B细胞激活剂,被广泛用于抗癌治疗[36-37]。其可以刺激树突状细胞,产生促炎细胞因子分泌、自然杀伤细胞活化和T细胞扩增等次生效应;在局部递送至肿瘤时,具有良好的抗肿瘤作用[38]。

Jillian L. Perry教授团队[39]利用PRINT(非润湿模板中的颗粒复制)纳米颗粒作为载体,通过气管注入法将CpG输送到小鼠肺部。在两种非小细胞肺癌-344SQ(肺腺癌)和KAL-LN2E1(肺鳞状癌)的小鼠原位转移模型中,局部递送到肺部的PRINT-CpG有效地促进了实质性的肿瘤消退,也限制了与可溶性CpG相关的全身毒性。此外,完全治愈小鼠可以抵抗肿瘤再次侵袭。此外,纳米递送结果显示这里纳米递送体系可以提高CpG在肺部的滞留时间,肺部抗肿瘤细胞因子的升高时间延长,但血清中促炎细胞因子的水平没有升高。这些结果表明, PRINT-CpG是一种有效的纳米平台,可用于局部治疗肺癌,对全身性疾病具有辅助治疗作用和较低的毒性,并且可能具有治疗其他癌症类型肺转移的潜力。

4 基于病毒载体的纳米药物

一些基于病毒的载体也被用作纳米技术工具用于癌症的免疫治疗[40]。例如, VIPER是一种病毒激发的内体释放聚合物,由一个多阳离子片段组成,用于核酸缩聚,以及一个pH敏感片段,将膜裂解肽(蜂毒肽)暴露在酸性环境中,以促进内体逃逸。Olivia M. Merkel团队[41]设计了一个腺病毒激发的聚合物系统(VIPER/siRNA)用于内体释放,并将该纳米颗粒与siRNA连接,将其传递给NCI-H1299 细胞, VIPER/siRNA 多聚物能在体内高效递送 siRNA,从而在肺部产生强大的基因沉默效应(>75%的基因敲除率)。

5 纳米疫苗

纳米疫苗逐渐成为在肿瘤治疗的研究热点之一, 增强疫苗抗原和添加佐剂有助于淋巴系统和免疫细胞的传递疗效[42]。更重要的是,肺是众多恶性肿瘤的转移好发部位,转移性肺癌是肿瘤相关死亡的重要原因。目前对大多数原发性肿瘤的常规治疗也会对免疫人群产生不良的脱靶效应[43]。因此构建肿瘤疫苗以预防和/或减少肺转移是一种潜在有前景的肺癌治疗策略。例如,有学者提出针对转移部位设计癌症纳米疫苗有机会防止转移性肺癌的发展。

Michael Donkor等[44]构建了一种经鼻递送的纳米疫苗,是由工程化CpG包覆的肿瘤抗原(Tag)纳米颗粒(NPs),可显著减少肺外肿瘤静脉转移。对肿瘤细胞肺定植的保护作用与诱导局部黏膜相关效应细胞和常驻记忆T细胞以及增加细支气管肺泡灌洗液IgA和血清IgG抗体反应有关。鼻腔纳米疫苗诱导T细胞介导的抗肿瘤黏膜免疫反应被证明可以增加肺源性CD8+T细胞的肿瘤特异性IFN-γ和颗粒酶B的产生。这项研究结果显示这种鼻纳米疫苗有可能在肿瘤在肺部播种之前起到预防性的作用,从而防止现有的恶性肿瘤出现肺转移。

6协同免疫治疗

6.1协同化学治疗二甲双胍(MET),通常用于治疗Ⅱ型糖尿病,最近被确定为一种潜在的抗癌药物[45-46]。作为 “老药新用”, MET通过激活单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)和抑制哺乳动物霉素靶标(mTOR)信号通路,抑制肿瘤细胞增殖和迁移,调节肿瘤免疫微环境,增加免疫细胞因子的产生,从而在化疗免疫疗法中发挥双重抗肿瘤作用[47-48]。

Shuxian Cai等[49]开发了一种基于双重治疗药物自组装的无载体纳米药物,通过结合化疗以增强抗肿瘤免疫治疗疗效。这个纳米药物由免疫佐剂二甲双胍(Met)和抗癌剂羟基喜树碱(SN38)通过氢键和静电相互作用自组装而成。MS NPs直接通过二甲双胍降低PD-L1水平,达到免疫治疗的目的。因此, MS纳米粒子的化学免疫治疗效果较其单一用药明显增强。MS纳米粒子还可以通过重塑细胞外基质和恢复免疫监视功能,有效抑制肿瘤转移。此外,接受MS纳米粒子处理的小鼠主要器官未观察到明显的毒性,且小鼠的存活率很高。

类似的, Tong Yang等[50]开发了透明质酸-顺铂/聚苯乙烯-聚二甲双胍(HA-CDDP/PMet)双前药共组装纳米颗粒,以精确的比例共递送CDDP和MET用于肺癌的化学免疫治疗。CDDP和MET的体外抗肿瘤效应提高了对Lewis肺癌细胞增殖抑制和凋亡诱导的协同作用。在体内,通过将HA-CDDP/PMet NPs与肿瘤细胞共培养, CDDP和MET在细胞内具有良好的裂解作用。这些纳米颗粒在携带Lewis肺癌的小鼠体内表现出显著的肿瘤富集和抑制肿瘤生长的作用,并显著延长了动物的存活时间,同时具有无肾毒性、游离药物和同源药物过量的缺陷。此外,有趣的是,在HA-CDDP/PMet NPs中, MET和CDDP的协同作用导致上调裂解聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)蛋白以诱导肿瘤细胞凋亡,并下调切除修复交叉补体组1(ERCC1)蛋白水平以降低对CDDP的耐药性。HA-CDDP/PMet NPs中MET和CDDP的协同作用还能诱导单磷酸腺苷(AMP)激活蛋白激酶-α(AMPK-α)通路,抑制雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)、最终发挥化疗作用,并通过增加 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、同时减少调节性 T(Treg)细胞以及增加细胞因子 IFN-γ 和 TNF-α 的表达来调节能动的免疫治疗功能。因此,由这种协同化疗/免疫治疗的纳米药物体系可能会为肺癌免疫药物的开发以及免疫治疗提供一种新颖的思路和策略。

6.2协同放射治疗放射治疗(RT)目前已经在临床中广泛使用,但其在部分肿瘤治疗中的疗效仍然有限[51]。其中主要原因之一即,由于程序性死亡配体-1 (PD-L1)表达扩增,缺氧条件下DNA损伤减轻,可以导致免疫耐受[52]。然而,有研究显示细胞内PD-L1表达抑制被证明可通过抑制DNA损伤修复而使RT更加敏感[53]。因此,构建良好的放射-免疫治疗模式对于肺癌的治疗具有良好的临床应用前景。

Saijun Wang等[54]构建了一种TPP-LND纳米颗粒,其通过将线粒体靶向的三苯基膦阳离子(TPP+)与抗肿瘤药物lonidamine (LND)连接合成,可以显著降低LND诱导有效氧化磷酸化抑制所需的剂量 (2 μMvs300 μM)。然后,用脂质体包裹TPP-LND形成TPP-LND@Lip纳米颗粒。TPP-LND@Lip纳米颗粒可以通过逆转肿瘤的缺氧微环境来产生更多的DNA损伤,并通过增强腺苷5’-单磷酸活化蛋白激酶的激活来降低PD-L1的表达,从而使RT增敏。在肺癌小鼠模型中, TPP-LND@Lip介导的PD-L1下调和缺氧逆转可有效致敏肺癌放疗,实现有效的放疗-免疫治疗疗效。

6.3多模态联合治疗鉴于纳米载体的良好的修饰性、负载性等优势,基于多模态联合治疗的纳米体系在肺癌免疫治疗中亦有开发[55-56]。

Xing Feng等[57]构建了一种多合一的纳米药物体系,由新型光热剂、 Mn修饰的酞菁衍生物(MnⅢPC)、多西紫杉醇(DTX)和有效靶向分子透明质酸组成。该纳米平台可以通过MnⅢPC@DTX@PLGA@Mn2+@ HA(MDPMH)释放Mn2+,并可能分别通过cGAS-STING 和化疗激活肿瘤免疫。此外, DTX可以在杀灭肿瘤细胞的过程中释放。结果显示,这种纳米药物介导的光热-化疗-免疫的联合疗法在肺癌的体内外模型中均获得了良好的肿瘤生长抑制的效果。

此外,Daxiang Cui教授团队[58]构建新型纳米平台GNS@CaCO3/Ce6-NK的新型纳米平台。GNS表面的CaCO3在细胞富集过程中, GNS表面的CaCO3涂层显示出突出的Ce6输送和保护效果。制备的多功能GNS@CaCO3/Ce6-NK细胞不仅具有荧光成像和光声成像的双重功能,同时通过NK源性细胞外壳主动靶向肿瘤组织,实现光热/光动力/免疫的三模态联合治疗。总而言之,这种新型的多模态纳米平台在体外和体内对A549肺癌细胞生长均具有良好的抑制效果。因此,通过结合纳米载体的优势,可以在一种纳米药物是实现多种治疗方案,联合多种治疗模式的优势,以实现更好的治疗效果。这种“多合一”的纳米药物体系可能会为肺癌的免疫治疗的发展提供一些新的启示。

纳米技术在免疫治疗研发的早期就显示出巨大的应用潜力和价值。纳米粒子可将最佳剂量的免疫药物、分子等输送到靶区,并降低药物的脱靶等副作用,这或将提高临床免疫药物的适用人群(如晚期或一般情况较差的老年患者);这些用途广泛的纳米平台可以在形状、大小、弹性、动力学、表面修饰和特异性靶向等方面进行改造,设计成为具有多种特性的纳米载体;此外,一些新型智能化的纳米粒子可与刺激响应性材料一起设计,实现在肿瘤特定微环境和特定时空下的免疫治疗药物释放,实现可控制的免疫治疗。

除了上述纳米药物的一些优势和研究进展外,在纳米药物的肺癌免疫治疗的研发方面仍具有一些可以改进的地方。(1)首先,应进一步优化纳米粒子的参数,如负载率、药代动力学、靶向特异性等。提高处于开发阶段的纳米免疫疗法的治疗效果,使其有在与传统疗法进行选择时具有更大的优势; (2)需要对设计的纳米药物进行机理、体外和体内深入研究,以确定对这种纳米粒子介导的免疫反应在人体内如何随时间演变,确定纳米粒子在体内的尺寸变化,以及生物分布、毒性和安全性、纳米载体及其携带分子的免疫原性,这些对于纳米药物的临床应用、转化具有重要意义; (3)要开发用于肺癌或者转移性肺癌免疫治疗的纳米颗粒,必须对肺癌生物学、微环境以及癌细胞与纳米颗粒之间的相互作用进行深入的探索和研究; (4)现阶段的纳米药物多停留于细胞、动物实验,制备过程较为苛刻、繁琐,很难大规模生产应用。因此,需要以临床应用为前提,鼓励进行广泛的临床前实验,重视开发具有高度可重复性特征的纳米药物,这对于未来的纳米药物临床转化、大规模生产具有重要的意义。