全自动密闭式组织脱水机的应用流程探讨

邓桃,周胜理,孔令非

(河南省人民医院 病理科,河南 郑州 450003)

近年来为了满足临床及病理诊断的需要,对组织制片的要求也越来越高。而组织蜡块脱水效果直接影响到组织制片及后续各项分子的检测[1-3]。科室每年制作的蜡块数量在11万左右,所以需要一套完善的固定脱水流程以满足实际需求。技术员在全自动脱水机的固定、脱水、透明、浸蜡等脱水流程的摸索中总结了一套适应科室的脱水流程,经过实践后,标本的处理效果更加满意,特别是活检小标本蜡块质量及切片质量完全满足诊断的需要。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集医院病理科接受的外科手术标本及各种穿刺、内窥镜夹取小标本。

1.2 仪器和试剂仪器:樱花全自动密闭式组织脱水机Tissue-Tek-VIPR6AI型11台,每台配备不锈钢标本框及盖子各2只,可容纳300个塑料大孔包埋盒或330个塑料细孔包埋盒。试剂:固定液(40 g·L-1的多聚甲醛溶液)、脱水剂(体积分数为75%、85%、95%、100%的酒精)、透明剂(二甲苯),均购自北京益利精细化学品有限公司;进口樱花石蜡(60～62 ℃)。

1.3 试剂设置樱花全自动密闭式组织脱水机附带12个试剂缸和4个蜡缸,改进前固定液、脱水剂、透明剂、浸蜡和清洗液按2∶6∶2∶4∶2配置,按改进后按1∶7∶2∶4∶2配置。改进前第1、2缸为40 g·L-1的多聚甲醛溶液,第3～8缸为梯度酒精,依次体积分数为75%的酒精1缸,体积分数为85%的酒精1缸,体积分数为95%的酒精2缸,体积分数为100%的酒精2缸,第9～10缸为二甲苯,第11～14缸为石蜡,第15缸为清洗液二甲苯,第16缸为清洗液体积分数为100%的酒精;改进后第1缸为40 g·L-1的多聚甲醛溶液,第2～8缸为梯度酒精,依次体积分数为75%的酒精1缸,体积分数为85%的酒精1缸,体积分数为95%的酒精2缸,体积分数为100%的酒精3缸,第9～16缸同改进前。固定液、清洗液需要4.2 L,其余试剂3.7 L。

1.4 脱水机程序改进前脱水机只设1种脱水程序,大小标本不分开运行(见表1)。当日所有送检标本不进行过夜预固定,新鲜标本取材后统一置入有病理编号的标本框,入脱水机过夜运行,组织间不留间隙,不需要真空、搅拌。试剂更换不区分大换和小换,所有试剂在使用1周后全部更换。试剂设置时前3缸石蜡用于浸蜡,第4个缸的蜡液备用不参与浸蜡。

表1 改进前标本脱水程序

1.5 脱水机程序改进后

1.5.1程序设定 根据组织大小设置常规脱水和小标本脱水2种程序,并固定2台脱水机负责活检小标本的固定脱水、透明、浸蜡。脱水机中试剂温度设定常温、浸蜡温度63 ℃,不需要真空、搅拌,组织在脱水机中过夜处理。送检大标本组织取材范围约为1.5 cm×1.5 cm×(0.2～0.3)cm,内镜及各种活检小标本取材全取,取材完毕后统一置入有病理编号的大孔包埋盒内和细孔包埋盒内[4],选择脱水程序进行处理(见表2)。

表2 改进后常规大、小标本脱水程序

1.5.2试剂更换 试剂更换分为脱水机大换和小换。脱水机大换是将第1缸40 g·L-1的多聚甲醛溶液、第2缸体积分数为75%酒精、第3缸体积分数为85%酒精倒掉,更换新的试剂;第4缸体积分数为95%酒精倒掉,第5缸体积分数为95%酒精前移,并将第4缸新更换的体积分数为95%酒精放在第5缸的位置;第6 缸体积分数为100%酒精倒掉,依次将第7、8缸体积分数为100%酒精前移,并第6缸新更换的体积分数为100%酒精放在第8缸的位置;将第9缸二甲苯倒掉,第10缸二甲苯前移,并将第9缸新更换的二甲苯放在第10缸的位置;第11缸的石蜡倒掉,后面石蜡依次前移,第14缸的蜡倒入第13缸,第14缸的蜡为新更换的石蜡。清洗液二甲苯和清洗液体积分数100%的酒精随脱水机大换更换新试剂。脱水机小换是将第1缸40 g·L-1的多聚甲醛溶液和第2缸体积分数为75%酒精更换,余试剂不更换。

1.5.3试剂更换指标 脱水机程序结束后检测第2缸体积分数为75%酒精浓度[5],观察包埋时组织脱水情况和镜下组织制片质量,同时参考脱水机使用登记表上蜡块数量及脱水机换液登记表上机器使用时间(见图1、2)。

图1 仪器设备使用登记表

图2 脱水机换液登记表

1.6 机器和标本框的清洗组织包埋后的标本框及盖子随脱水机一起清洗。脱水机清洗需要72 min,经过60 ℃ 10 min预热,然后经过4遍二甲苯和2遍体积分数为100%酒精循环清洗,其间不需要加压、真空及循环搅拌。

1.7 组织脱水质量评价脱水后组织软硬程度,组织蜡块久置,观察是否发生干涸、表面是否凹陷变形。并在镜下观察组织切片结构的完整性、厚薄均匀程度、染色情况、形态、组织有无断裂或破碎情况等。

2 结果

2.1 组织肉眼观脱水程序改进前部分组织蜡块脱水不足,组织发白且发硬、中心有凹陷(图3);改进后组织软硬适中、有弹性,久放无凹陷,较硬的组织,如宫颈组织效果明显,尤其是内镜及活检小标本分开处理后对比明显(图4)。

图3 脱水程序改进前部分组织蜡块

图4 脱水流程改进后肉眼观

2.2 病理切片镜下观察脱水程序改进前组织切片易脆、易碎、有裂隙皱褶、染色红蓝对比不清晰、组织有发白、变灰及脱水不尽等现象(图5);改进后切片厚薄均匀、染色鲜艳、细胞结构清晰、红蓝对比明显(图6)。

A为子宫肌壁标本;B为皮下组织标本;C为淋巴结标本;D为肌肉组织标本。

A为乳腺浸润性癌术后标本;B为乳腺浸润性癌穿刺标本;C为肝细胞性肝癌手术大标本;D为肝细胞性肝癌穿刺标本。

3 讨论

改进后的脱水程序设定不但根据试剂的种类及组织的大小,还考虑每一环节需要的时间、温度、压力等指标,保证各个指标的合理性以达到最佳的脱水效果。按送检组织大小设置2种脱水程序,分别处理手术标本及冰冻转常规标本及穿刺或内镜等直径小于0.3 cm的标本。2种程序把大小标本分开处理,既避免大标本的脱水不足又避免小标本的处理过度,更方便掌握试剂更换时间。一般当天下午脱水机开始运行,第2天上午8点程序结束,开始包埋工作。上机前仔细检查组织包埋盒是否扣紧,尤其细孔小包埋盒,以防组织丢失。

组织处理的第1步是固定,固定的好坏直接关系到病理制片的优良。改进后的脱水流程对当日送检的大标本进行过夜预固定,第2天取材,但特殊的标本如包膜厚的标本及空腔标本应规范切开再过夜预固定,固定时间大于12 h,脱水机第1缸为40 g·L-1的多聚甲醛溶液补充固定,固定充分;对于当日送检的活检及内镜小标本则当日取材后入脱水机处理,特别小的组织用易透水的薄纸包好后放入细孔包埋盒,以免组织在脱水机循环处理中丢失。改进后每个标本框中的包埋盒数量不超过规定数量,否则组织间会互相拥挤重叠,影响试剂完全浸没组织。包埋盒太紧会带出来少量前1缸试剂,其与下1缸试剂混合,影响脱水。一般情况下标本框容纳135个大孔包埋盒或细针小孔包埋盒165个,这样保证了每1个组织完全浸没,提高了固定效果。

组织脱水是用脱水剂将固定组织内的水分逐渐置换出来,便于透明剂和石蜡的渗入,酒精是最常用的脱水剂,且酒精浓度对脱水质量影响最为明显。高浓度的酒精会使蛋白质凝固,组织表面变硬,致使酒精无法浸到组织深处;低浓度酒精不能把组织内的水分充分置换,组织太软,蜡块中心容易出现凹陷,影响制片,所以选用梯度酒精进行组织脱水,避免了一刀切的现象。改进后的脱水流程首先从低体积分数为75%的酒精溶液开始,然后经体积分数为85%酒精、2缸体积分数为95%酒精、3缸体积分数为100%酒精,使组织内的水分脱除干净有利于二甲苯进入透明。同时组织内蛋白质、脂肪等杂质也存在于酒精中,减弱酒精脱水效果。所以检测每次脱水后第2缸体积分数为75%酒精的浓度,并肉眼观察试剂是否浑浊,以便及时更换试剂,更好发挥脱水机的应用。改进后的脱水流程中发现在试剂大换时,在第8缸新更换的体积分数为100%酒精里加入1～2 g的水溶性伊红[6-7],组织标本内的水分经过梯度酒精脱水,会逐渐置换出来,溶液内的伊红就会浸染进去,组织标本变成红色,这样组织与石蜡、异物在包埋时能直观辨别出来,对于活检及内镜小标本也更容易区分,提高组织包埋效率。

二甲苯是常用的透明剂,改进脱水程序后组织在二甲苯要过夜处理,中间不需加压、搅拌,时间不宜超过60 min,透明时间过长,组织容易变硬脆,制片困难。2种脱水程序透明时间不同,程序选择要正确,这样组织透明才充分。浸蜡是透明后的组织在熔化的石蜡中浸渍,使石蜡充分渗入组织内。樱花石蜡的熔点60～62 ℃,浸蜡的温度应稍高于石蜡熔点,以63 ℃为佳。改进后的脱水程序设立4个蜡缸,因为第1缸石蜡含少量二甲苯,二甲苯会造成组织硬脆,影响制片,组织标本在第1缸石蜡中停留时间稍短,第2～4个蜡缸可以让组织充分浸蜡,如果偶尔当天脱水机运行太晚,影响第2天包埋,也可以当脱水程序运行到第4缸蜡时提前20 min终止程序,实践证明也不影响包埋质量及制片效果。

脱水机程序改进前单凭试剂使用的时间来更换试剂,不能保证酒精梯度脱水,固定液的效果也大大减弱。改进后的试剂是否需要更换[8],不再仅凭试剂使用时间和次数或蜡块登记数量等其中一种因素决定,因为每日处理的标本数量[9]、标本组织大小对试剂浓度下降的影响程度都不确定。在日常工作中,通过检测酒精浓度,发现了每缸酒精浓度在每个试剂更换周期内的变化规律,并且酒精浓度的变化规律和累积处理组织蜡块数量有一定的关联,特别是第2缸体积分数为75%酒精的浓度变化有明显的一致性,所以工作人员以第2缸体积分数为75%酒精浓度为指标,而且体积分数为75%酒精的浓度很容易测量,使用酒精比重计即可。

当酒精比重计检测第2缸酒精体积分数本应为75%却低于62%,常规程序处理手术大标本累积850个左右或小标本程序处理小标本累积450个左右时,同时固定液40 g·L-1的多聚甲醛出现浑浊沉淀,组织经脱水处理后如出现制片困难,同时镜下染色不鲜艳,达不到优质切片时,脱水机小换;第2缸酒精体积分数本应为75%却低于62%,脱水机处理大标本为1 750个左右或小标本850个左右时,40 g·L-1的多聚甲醛固定液出现浑浊沉淀,组织经脱水处理后制片困难,同时镜下染色结构不清晰,达不到优质切片,脱水机大换。每次更换试剂不像之前简单的采用滚动更换试剂的方法[10],而是在脱水机2次大换之间,进行1次脱水机小换,既保证了脱水的质量,又减少了试剂的浪费。试剂是否需要更换,何时更换,需要脱水机大换还是脱水机小换,不仅以脱水机处理标本量作为参考指标,还要根据第2缸体积分数为75%酒精的浓度来衡量,特别在节假日期间处理蜡块的累积数量即使达不到试剂更换指标,但时间间隔太长,效果也会下降,所以通常是综合考虑更换试剂。很多细节会影响脱水的质量以至影响制片,所以科室也建立了规范的脱水流程。技术员每次上机前检查试剂液面是否到位,试剂顺序是否正确,试剂有无污染,试剂缸是否连接紧密,脱水机使用登记表和脱水机试剂更换登记表是否登记,以便更好地发挥脱水机的优势。

脱水机长期于固定液及脱水剂的环境中工作,极易产生杂质附着在管道中,而这些杂质如未及时清理,不仅影响脱水机处理效力,也较易对机器本身造成损害[11]。脱水机脱水程序运行结束后,应用纱布将脱水缸中处于熔融状态的蜡擦拭干净,脱水缸底部有1个过滤漏孔,应将过滤器漏孔上附着的杂质及脱水缸密封圈上残留过多石蜡清除。待把脱水机擦拭干净后将标本框置入脱水机内随脱水机走清洗程序一起清洗72 min。若标本框未经清洗进入脱水程序容易堵塞管道,组织脱水不佳,影响制片,所以每次脱水程序运行前一定检查机器和标本框是否清洗,以免影响组织脱水效果。

综上,通过对全自动密闭式组织脱水机的应用探讨,病理技术人员总结出一套适合于本科室的脱水流程,充分利用脱水机的优势,制作高质量的病理切片,满足病理诊断及临床的需要。