咳嗽变异性哮喘患儿血miR-34a表达水平与免疫失衡状态和炎症反应的关系研究

黄良龙 张利诚 王涛 金晓辉

作者单位：314000 嘉兴，中国人民武装警察部队海警总队医院呼吸科

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一种气道的慢性炎症反应性疾病，属于常见的非典型哮喘，主要或唯一表现为无喘息的阵发性夜间咳嗽[1]。有研究报道，CVA 在慢性咳嗽病因学中所占比例最高，为32.6%，是我国儿童慢性咳嗽最重要的病因之一[2]，有40%～50%的患儿可能进展为典型哮喘[3]。CVA的特点是隐发、病程长、反复发作，直接影响患者的学习、生活、工作、睡眠质量，给患者及其家属带来巨大的经济和精神负担。近年来，miRNA 参与气道疾病发病过程的研究受到医学界的关注。有研究发现一些miRNA 参与哮喘、慢性阻塞性肺疾病等疾病的气道慢性炎症过程[4]，而其过程多由于Thl/Th2 免疫失衡导致相应炎症因子分泌变化[5]。研究报道，miR-34 家族与各种肺部疾病密切相关，miR-34a 参与哮喘过程，但目前研究鲜有探讨miR-34a 与CVA 的关系[6]。因此，本研究以CVA 患儿和健康儿童为研究对象，探讨血miR-34a 表达水平与CVA 患者免疫失衡状态和炎症反应的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019 年1 月至2021 年12 月中国人民武装警察部队海警总队医院呼吸科收治的CVA 患儿92 例为研究对象（CVA 组），其中男48 例，女44 例；年龄4～14（8.04±1.93）岁；有家族过敏史43 例；有个人过敏史61 例。纳入标准：（1）符合《中国儿童慢性咳嗽诊断与治疗指南（2013 年修订）》[6]中CVA 的诊断标准；（2）纳入研究前患儿未经系统治疗；（3）血液标本采样前48 h 未使用激素类、支气管扩张剂、白三烯受体拮抗剂、抗组胺类等药物。排除标准：（1）合并其他严重肺部疾病；（2）合并其余部位感染；（3）合并其他免疫性疾病；（4）合并其他肿瘤；（5）严重肝、肾功能损害。另选取同期在本院健康体检的儿童86 名为健康组，其中男45 名，女41 名；年龄4～13（7.89±2.06）岁；有家族过敏史4 名；有个人过敏史3 名。两组研究对象性别和年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但家族过敏史和个人过敏史比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有患儿监护人均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）取入院当天两组研究对象清晨空腹外周静脉血5 ml，将获取的血液标本置于EDTA 抗凝管中，摇晃混匀后静置20 min，以5 000 r/min 转速、3.5 cm半径、4 ℃环境离心处理15 min，分层后吸取上层血清装于EP 管中，在-80 ℃低温冰箱中贮存待测。（2）血miR-34a 表达水平检测：采用实时荧光定量PCR 法检测血miR-34a 表达水平。使用Trizol 试剂（批号：R0016，上海Beyotime 公司）从血中提取总RNA。用反转录试剂盒（批号：D7180M，上海Beyotime 公司）将提取的总RNA 逆转录为cDNA，后PCR 扩增仪（湖南圣洲生物科技有限公司，湘械注准20212220277，型号：Cycler Z200）中扩增，反应体系20 μl，反应条件为预变性95 ℃30 s，95 ℃5 s，扩增60 ℃44 s，40 个循环。U6 小核RNA（U6 small nuclear ribonucleoprotein particle，U6snRNA）引物序列，上游：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游：5'-AAAATATGGAACGCTTCACGA-3'；miR-34a 引物序列，上游：5'-CGGTATCATTTGGCAGTGTCT-3', 下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。以U6snRNA 为内参，以2-ΔΔCt法计算miR-34a 相对表达水平。（3）使用全自动血液分析仪（北京指真生物科技有限公司，京械注准20192220036，型号：C511）检测血嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）水平。（4）使用FACSVerse流式细胞仪（常州必达科生物科技有限公司，苏械注准20222221435，型号：BeamCyte-1025M）检测Th1、Th2比例并计算两者比值，具体方法参考文献[7]。（5）血炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 水平检测：采用ELISA 法。ELISA 试剂盒（批号分别为20180701、20180506、20180805、20180305、20180302、20180603）购自上海酶联生物科技有限公司，酶标仪为迈瑞MR-96A 酶标仪全自动酶标仪，严格根据试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；采用Pearson 相关分析CVA组患儿miR-34a 表达水平与EOS 水平、Th1/Th2 比值及炎症因子水平的相关性；采用二元logistic 回归分析影响CVA 发生的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象miR-34a表达水平比较 CVA组患儿血miR-34a 表达水平为0.56±0.21，明显低于对照组的1.11±0.38，两组比较差异有统计学意义（t=12.054，P＜0.01）。

2.2 两组研究对象EOS 水平、Th1 及Th2 比例和Th1/Th2 比值比较 与健康组比较，CVA 组患儿血EOS 水平和Th2 比例明显升高，Th1 比例和Th1/Th2 比值明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。

表1 两组研究对象EOS水平、Th1及Th2比例和Th1/Th2比值比较

2.3 两组研究对象炎症因子水平比较 与健康组比较，CVA 组患儿血TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 水平明显升高，IFN-γ 和IL-2 水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2。

表2 两组研究对象炎症因子水平比较（μg/L）

2.4 CVA 组患儿miR-34a 表达水平与EOS 水平、Th1/Th2 比值及炎症因子水平的相关性分析 CVA组患儿血miR-34a 表达水平与Th1/Th2 比值呈正相关（r=0.663，P＜0.01），与EOS、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 水平均呈负相关（r=-0.606、-0.578、-0.490、-0.817、-0.787，均P＜0.01），而与IFN-γ、IL-2 均无相关性（r=0.046、0.137，均P＞0.05）。

2.5 影响CVA发生的因素分析 以miR-34a（具体检测值）、EOS升高（＜0.50×109/L=0，＞0.50×109/L=1）、Th1/Th2 比值（具体检测比值）、IL-6 降低（＞67.3 μg/L=0，＜67.3 μg/L=1）、IL-2（具体检测值）、TNF-α（具体检测值）、IFN-γ（具体检测值）、IL-10（具体检测值）、家族哮喘史（无=0，有=1）、个人过敏史（无=0，有=1）、家族过敏史（无=0，有=1）为自变量，以是否发生CAV 为因变量（发生=1，未发生=0），进行二元logistic 回归分析，结果显示miR-34a 表达水平、Th1/Th2 比值均是影响CAV发生的独立保护因素（均P＜0.05），而EOS水平升高、个人过敏史、IL-6 水平降低均是影响CAV 发生的独立危险因素（均P＜0.05），见表3。

表3 影响CVA发生的二元logistic回归分析

3 讨论

CVA 是由免疫、遗传和环境等多因素导致多种细胞和细胞因子受累的特殊的慢性复发性气道疾病，其发病机制与典型哮喘相似，且抗生素对其无效。EOS、T 细胞等多种炎症细胞及炎症介质参与CVA 患者的气道慢性炎症反应，持续的炎症损伤可加剧气道高反应性，患者通常在早晨和夜间咳嗽加剧，这对患者的日常生活和心理造成极大的影响[8]。miRNA 为长度在19～30 个核苷酸之间的非编码RNA，参与细胞分化、生长、发育、代谢、信号传导和凋亡及与癌症和炎症相关的疾病过程[9]。有研究表明miR-34a 参与肺的发育和部分疾病的发生[10]。朱萍等[11]研究显示，支气管哮喘患者的血miR-34a 与气道炎症显著相关。

本研究中，与健康组比较，CVA 组患儿血miR-34a表达水平降低、EOS 水平升高，与朱萍等[11]研究结果相似。与健康组比较，CVA 组患儿Th1 比例、Th1/Th2 比值、IFN-γ、IL-2 水平降低，EOS 水平、Th2 比例、TNFα、IL-4、IL-6、IL-10 水平升高，与王志刚等[12]、陈巧俊等[13]研究结果相近。CVA 患者的气道慢性炎症表现为EOS 水平升高、Th2 活化甚至Th1/Th2 免疫失衡，是导致哮喘的重要发病机制[14]。EOS 为反映气道炎症活动的重要指标，可分泌IL、细胞因子和EOS 阳离子蛋白。当EOS 过度活化时，EOS 阳离子蛋白可引起肥大细胞大量释放组胺，与IL、细胞因子等炎症介质共同损害气道上皮细胞，暴露气道内皮下的刺激感受器，导致气道高反映性[15]。Th1通过分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等介质调节细胞免疫，Th2 则通过分泌IL-4、IL-6、IL-10等介质介导体液免疫应答。Th1、Th2 在正常机体内中维持动态平稳，失衡则表示机体免疫功能紊乱[16]。

相关分析结果显示，CVA 组患儿血miR-34a 与Th1/Th2 比值呈正相关,与EOS、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 水平均呈负相关；二元logistic 回归分析发现miR-34a、Th1/Th2 比值均是影响CAV 发生的独立保护因素，而EOS 水平升高、个人过敏史、IL-6 降低均是影响CAV 发生的独立危险因素。提示miR-34a、Th1/Th2 比值、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 均参与气道炎症的发生，且miR-34a 下降、Th1/Th2 比值下降、EOS 水平升高、IL-6 降低及个人过敏史会增加儿童发生CVA 的风险，可以作为诊断CVA 的指标。有研究报道，IL-2、IL-4、IL-6 及IFN-γ 为调节Th1/Th2 平衡的关键，IL-2 可诱导Th0 细胞向Thl 细胞分化，IL-4、IL-6 可诱导Th0 细胞向Th2 细胞分化，IFN-γ则可抑制IL-4诱导T细胞分化[16-18]。本研究发现miR-34a下降可导致CAV发生，结合上述研究，机制可能是miR-34 的下调导致EOS、IL-4、IL-6、IL-10 升高，炎症反应增强，且通过IL-4、IL-6诱导Th2 的分化，使Th1/Th2 比值降低，致免疫失衡，体液免疫增强，Th2 分泌的炎症因子增多、恶性循环加重患者的气道炎症反应和高反应性。据目前研究报道，miR-34a 可通过介导MAPK 信号通路、Notch 信号通路及影响自噬，致炎症因子增加，从而影响支气管哮喘、过敏性鼻炎患者气道炎症反应，但以上机制是否与CVA 气道炎症的发生相关还有待研究[11,19]。

综上所述，CVA 患儿血miR-34a 表达下调，可能通过上调EOS 水平和下调Th1/Th2 比例，促进IL-6 分泌，进而诱发CVA。本研究不足之处在于无法判断这些影响因素的因果关系，需进一步对CVA 与miR-34a 研究。