胃肠胰神经内分泌肿瘤中CD117 的临床病理意义和KIT突变检测

沈文艳 周泉 许建秋 胡晓岚 于亚威

作者单位：314000 嘉兴市第二医院病理科

神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasms，NEN）泛指所有起源于肽能神经元和神经内分泌细胞，从表现为惰性、缓慢生长的低度恶性到高转移性等明显恶性的一系列的异质性肿瘤。神经内分泌细胞遍布全身各处，因此NEN 可以发生在体内任何部位，在过去10 年中，NEN 的年发病率已上升至每10 万人中超过3例，具体取决于原发部位。其中以胃肠胰NEN（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms，GEP-NEN）最常见，约占所有NEN 的2/3[1]。CD117 作为KIT 原癌基因（kit proto-oncogene，KIT）的蛋白表达产物，是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白。胃肠道间质瘤、白血病、黑色素瘤、小细胞肺癌等多种人类肿瘤组织中均存在CD117 的异常表达和KIT 基因突变。近年来，许多研究者把CD117 作为分子靶向治疗的新课题进行研究[2-3]。本研究旨在探讨GEP-NEN 中CD117 表达的临床病理意义及与预后的相关性，通过检测CD117表达阳性的GEP-NEN 中KIT 基因突变识别可能存在的突变位点。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2011 年1 月至2019 年12 月嘉兴市第二医院收治的GEP-NEN 患者111 例，男60 例，女51例；发病年龄30～67 岁，中位年龄55 岁；肿瘤直径为1～7 cm，中位数为2.1 cm。复习患者HE 染色切片，并根据《世界卫生组织消化系统肿瘤分类》（第5 版）[4]进行分类，其中神经内分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET）G1（核分裂计数＜2/10 HPF，Ki-67＜3%）70 例，NET G2[核分裂计数（2～20）/10 HPF，Ki-67 3%～20%]14 例，NET G3（核分裂计数＞20/10 HPF，Ki-67＞20%）2 例，神经内分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）（分化差，高级别肿瘤）25 例。本研究经医院医学伦理委员会审批通过（伦理编号：jxey-2017037）。

1.2 主要试剂和仪器 CD117 兔抗人单克隆抗体（批号：YR145）购自福州迈新生物技术开发有限公司；Ki-67 兔抗人单克隆抗体（批号：MyR1-ki67）及p53 鼠抗人单克隆抗体（批号：MyM1-P53）均购自杭州安必平医药科技股份有效公司；视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）鼠抗人单克隆抗体（批号：13A10）及生长抑素受体（somatostatin receptor2，SSTR2）兔抗人单克隆抗体（批号：EP149）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二抗通用试剂及二氨基联苯胺（DAB）（批号：41365748C）试剂均购自丹麦Dako 公司。石蜡组织DNA 提取试剂盒（批号：2020073001）购自基因科技（上海）股份有限公司；PCR 仪（型号：伯乐T1000）购自杭州朗基科学仪器有限公司；测序仪（ABI 3500XL DX）购自新加坡Life Technologies 公司。

1.3 CD117 表达检测 采用免疫组化En Vision 染色法。常规石蜡包埋组织，3 μm 厚切片，75 ℃烤片1 h，常规脱蜡脱水后用pH 9.0 的EDTA 作为抗原修复液，100 ℃煮沸修复20 min，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶6 min，滴加CD117 一抗室温孵育2 h，二抗室温孵育0.5 h，DAB 显色，苏木精复染，中性树脂封固。鉴别NET G3 和NEC 有困难时加做Ki-67、p53、Rb 和SSTR2检测。在进行CD117 免疫组化染色时以既往染色阳性的胃肠间质肿瘤作为阳性对照，PBS 代替一抗作为空白对照，瘤旁正常组织作为自身正常对照。

1.4 免疫组化染色判读标准 CD117 表达是否阳性需要在高倍镜（400 倍）下观察细胞着色程度，阳性细胞的细胞膜及胞质为棕黄色，高倍镜下取4 个不同视野各计数200 个癌细胞，按阳性细胞所占百分比分为阴性（不显色或阳性细胞所占百分比＜10%）和阳性（阳性细胞所占百分比≥10%）[5]。Rb 以胞核着色为阳性。SSTR2 以细胞膜染色强度分为阴性（无染色）、弱阳性（黄色）、中等阳性（棕黄色）和强阳性（棕褐色），以胞膜线性中等强度以上染色为阳性着色。Ki-67 阳性指数挑选表达最强的区域计数500～2 000 个细胞，再计算出阳性百分比[6]；p53 蛋白弥漫细胞核着色（≥75%）或完全阴性定义为突变型表达。

1.5 KIT 基因突变检测 由杭州迪安医学检验中心对CD117 表达阳性的1 例NET G3 和10 例NEC 标本的KIT 基因外显子9、11、13、17 进行突变检测。按照石蜡组织DNA 提取试剂盒中相关说明仔细提取蜡块组织的DNA，以PCR 扩增KIT 基因中的外显子9、11、13、17。PCR 反应体系（50 μl）：甜菜碱5 μl，5×Go Taq Buffer 10 μl,MgCl26 μl,dNTP 1 μl,P1 0.5 μl,P2 0.5 μl,Go Taq 酶0.2 μl,ddH2O 24.8 μl,DNA 2 μl。反应条件：95 ℃变性3 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，循环40 次，最后72 ℃5 min，4 ℃结束反应。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳确定后，然后进行Sanger 测序，用ABI 3500XL DX 测序仪进行序列分析，有突变的标本再进行反向测序证实，确定基因突变类型。

1.6 随访 通过电话对患者进行随访，随访时间从确诊之日算起，截止日期为2020 年12 月31 日，在随访期内出现患者死亡则终止随访。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线，并行log-rank 检验和多因素Cox 回归分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GEP-NEN 患者CD117 的表达 CD117 主要表达于GEP-NEN 细胞膜，也可表达于细胞质中（图1）。GEP-NEN 患者CD117 阳性表达率为18.9%（21/111），其中NET 和NEC 患者CD117 阳性表达率分别为12.8%（11/86）和40.0%（10/25），两组比较差异有统计学意义（χ2=7.659，P＜0.01）。NET 患者中，G1、G2 和G3 患者CD117 阳性表达率分别为7.1%（5/70）、35.7%（5/14）和50.0%（1/2），3 者比较差异有统计学意义（χ2=10.033，P＜0.01）。

2.2 NET G3 的免疫组化结果 2019《世界卫生组织消化系统肿瘤分类》对消化系统NEN 分类进行了更新，GEP-NEN 的主要变动是G1 级的Ki-67 阳性指数的界值由＜2%调整到＜3%，并且提出了“NET G3”的概念[4-7]。本组病例G1 重新划分后变化不大，而2 例过去分类有争议的NEN 被归入了NET G3。NET G3 表达Rb 和SSTR2，Ki-67 约25%，p53 野生型（图2）。其中1例NET G3 表达CD117（图1C-D），并且在后续的KIT基因分析中检测到突变。

图1 GEP-NEN 中CD117 的免疫组化表达结果（A:CD117 表达阴性，En Vision 染色，×100；B:CD117 表达阴性，En Vision 染色，×400；C:CD117 表达阳性，En Vision 染色，×100；D:CD117 表达阳性，En Vision 染色，×400）

图2 NET G3 的组织学形态和免疫组织化学表现（A: 肿瘤细胞排列呈实性巢状，小梁状，腺管样伴有纤细血管网，HE 染色，×100；B:直肠NET G3 肿瘤细胞Rb 表达阳性，En Vision 染色，×100；C：直肠NET G3 肿瘤细胞SSTR2 表达强阳性，En Vision 染色，×100；D：直肠NET G3 肿瘤细胞，热点区Ki-67 阳性指数约25%，En Vision 染色，×100；E：直肠NET G3 肿瘤细胞p53 蛋白呈局灶弱阳性表达，En Vision 染色，×100）

2.3 不同临床病理特征GEP-NEN 患者CD117 阳性表达率的比较 不同性别和年龄患者CD117 阳性表达率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但不同肿瘤直径、肿瘤分级和有无淋巴结转移患者CD117阳性表达率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 不同临床病理特征GEP-NEN患者CD117阳性表达率的比较[例(%)]

2.4 CD117 阳性表达与患者预后的关系 GEP-NEN组中，CD117 阳性表达和阴性表达患者的中位生存时间分别为60 和68 个月，两者比较差异无统计学意义（log-rankχ2=0.797，P＞0.05），见图3。NEC 组中，CD117 阳性表达和阴性表达患者的中位生存时间分别为24 和29 个月，两者比较差异无统计学意义（logrankχ2=0.144，P＞0.05），见图4。NET 组中，CD117 阳性表达和阴性表达患者的中位生存时间分别为70 和68 个月，两者比较差异无统计学意义（log-rankχ2=0.634，P＞0.05），见图5。多因素Cox 回归分析显示性别、年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、CD117 表达与GEPNEN 患者生存时间均无关（均P＞0.05），见表2。

图3 CD117阳性表达和阴性表达的GEP-NEN患者的生存曲线

表2 影响GEP-NEC患者生存时间的多因素Cox回归分析

图4 CD117 阳性表达和阴性表达的NEC 患者的生存曲线

2.5 突变检测 1 例NET G3 患者的KIT 17 号外显子H790Y（CAC＞TAC）突变，c 部分突变成t，是错义突变（杂合突变），推荐药物为格列卫和舒尼替尼，见图5（封三）。10 例NEC 患者未能检测到KIT基因突变。

图5 1 例直肠NET G3 患者的KIT 突变测序图谱，可见H790Y（CAC＞TAC）突变

3 讨论

本研究中，NET 和NEC 患者CD117 阳性表达率比较差异有统计学意义，NET 的3 个级别之间比较差异亦有统计学意义，且表达率随着肿瘤级别的升高而上升。Erler 等[8]发现CD117 在高级别的NEC 中表达也明显升高。Knösel 等[9]发现高CD117 表达与较高的WHO分级有关（低级别9%，中级别14%，高级别28%），叶郁红等[10]亦发现了类似趋势。CD117 的表达和NEN 分级有关联，提示对于形态上介于高、低级别之间的NEN，CD117 的表达可能成为分级的辅助手段。

CD117 是一种与癌症进展相关的酪氨酸激酶受体。本研究发现CD117 表达与肿瘤直径、淋巴结转移均有关，这与叶郁红等[10]的研究结果类似，提示CD117在GEP-NEN 侵袭转移中起着一定作用。但本研究发现CD117 与GEP-NEN、NET、NEC 患者预后均无关。文献报道对此存在争议，Akintola-Ogunrem 等[11]发现CD117 在结直肠NEC 中的表达和患者预后无关；与之相反，Knösel 等[9]发现CD117 的高表达与较短的疾病特异性生存期有关，可作为预后指标；Son 等[12]发现CD117 表达与胰腺NET 患者的生存率降低有关，但不是一个独立的预后因素。这些研究结果的不一致可能是由于肿瘤分类（WHO 诊断标准的变迁）、CD117 表达的评分参数、肿瘤位置这些因素的不统一造成的。

Perkins 等[13]运用靶向测序法在1 例伴有肝转移的胰腺NEN 中检测到KIT 第11 外显子的突变，运用伊马替尼治疗后肝脏转移灶体积显著缩小。Neychev 等[14]对晚期GEP-NEN 患者进行包括KIT 在内的基因突变检测，然后使用舒尼替尼或依维莫司靶向治疗，并观察是否可以改变无病生存期。这些实验发现鼓励本研究小组对CD117 阳性的NET G3 和NEC 进行KIT 突变检测，最终在1 例直肠NET G3 检出了17 号外显子的新突变，为错义突变，即第790 处氨基酸由His 突变成Tyr（H790Y）。通过COSMIC 数据库搜索KIT“H790Y”突变位点，发现Sharpe 等[15]对基底细胞癌患者进行全外显子筛查的实验结果中有相同的突变位点。但是在NEN 并无相同位点的报道，这是首次在直肠的NET G3 中发现的一个新的突变位点，具体功能有待进一步的研究。目前，GEP-NEN G3 肿瘤的临床研究非常有限，现在一般认为NET G3 患者比NEC 患者有更长的生存时间[16-17]。药物治疗方面，NET G3 对以铂类为基础的化疗不敏感，可采用生长抑素类似物、靶向药物、核素治疗和替莫唑胺为基础的化疗；而NEC 对以铂类为基础的一线化疗灵敏度较高[18-19]。类似这样的NET G3, KIT 突变检测发现17 号外显子突变，是否可以予以用酪氨酸激酶抑制剂治疗，有待进一步研究。加深对NET G3 的认识，能帮助临床正确选择治疗策略并准确评估患者预后。

综上所述，GEP-NEC 中CD117 表达水平高于GEP-NET，可对分级起到辅助诊断的作用。CD117 表达与肿瘤直径、淋巴结转移均有关，但与患者预后无关，不是一个有效的预后标志物。此外，本研究发现1个直肠NET G3 新的KIT 突变位点，这为NET G3 患者治疗开辟了新途径，为GEP-NEN 中突变分析的治疗重要性提供了证据。